A nanostructured, carbon-based physical catalyst electrochemically reduces N 2 to ammonia under ambient conditions.

Many industrial chemicals that are produced from fossil resources could be manufactured more sustainably through fermentation. Here we describe the development of a carbon-negative fermentation route to producing the industrially important chemicals acetone and isopropanol from abundant, low-cost waste gas feedstocks, such as industrial emissions and syngas. Using a combinatorial pathway library approach, we first mined a historical industrial strain collection for superior enzymes that we used to engineer the autotrophic acetogen Clostridium autoethanogenum. Next, we used omics analysis, kinetic modeling and cell-free prototyping to optimize flux. Finally, we scaled-up our optimized strains for continuous production at rates of up to ~3 g/L/h and ~90% selectivity. Life cycle analysis confirmed a negative carbon footprint for the products. Unlike traditional production processes, which result in release of greenhouse gases, our process fixes carbon. These results show that engineered acetogens enable sustainable, high-efficiency, high-selectivity chemicals production. We expect that our approach can be readily adapted to a wide range of commodity chemicals.

ABSTRACT As the focus for CRISPR edited plants moves from proof-of-concept to real world applications, precise gene manipulation will increasingly require concurrent multiplex editing for polygenic traits. A common approach for editing across multiple sites is to design one gRNA per target; however, this complicates construct assembly and increases the possibility of off-target mutations. In this study, we utilized one gRNA to target MYB186 , a known positive trichome regulator, as well as its paralogs MYB138 and MYB38 at a consensus site for mutagenesis in Populus tremula × P. alba INRA 717-1B4. Unexpected duplications of MYB186 and MYB138 resulted in a total of eight alleles for the three targeted genes in the hybrid poplar. Deep sequencing and PCR analyses confirmed editing across all eight targets in nearly all of the resultant glabrous mutants, ranging from small indels to large genomic dropouts, with no off-target activity detected at four potential sites. This highlights the effectiveness of a single gRNA targeting conserved exonic regions for multiplex editing. Additionally, cuticular wax and whole leaf analyses showed a complete absence of triterpenes in the trichomeless mutants, hinting at a previously undescribed role for the non-glandular trichomes of poplar. ONE SENTENCE SUMMARY Targeting conserved sequences with a single gRNA allowed efficient mutagenesis of a multigene family and the recovery of trichomeless and triterpene-free poplar mutants.

ABSTRACT Trees are associated with a broad range of microorganisms colonising the diverse tissues of their host. However, the early dynamics of the assembly of the microbiota from the root to shoot axis and how it is linked to root exudates and metabolite contents of tissues remain unclear. Here, we characterized how fungal and bacterial communities are altering root exudates as well as root and shoot metabolomes in parallel with their establishment in poplar cuttings ( Populus tremula x tremuloides clone T89) over 30 days of growth. Sterile poplar cuttings were planted in natural or gamma-irradiated soils. Bulk and rhizospheric soils, root and shoot tissues were collected from day 1 to day 30 to track the dynamic changes of fungal and bacterial communities in the different habitats by DNA metabarcoding. Root exudates and root and shoot metabolites were analysed in parallel by gas chromatography-mass spectrometry. Our study reveals that microbial colonization triggered rapid and substantial alterations in both the composition and quantity of root exudates, with over 70 metabolites exclusively identified in remarkably high abundances in the absence of microorganisms. Noteworthy among these were lipid-related metabolites and defence compounds. The microbial colonization of both roots and shoots exhibited a similar dynamic response, initially involving saprophytic microorganisms and later transitioning to endophytes and symbionts. Key constituents of the shoot microbiota were also discernible at earlier time points in the rhizosphere and roots, indicating that the soil constituted a primary source for shoot microbiota. Furthermore, the microbial colonization of belowground and aerial compartments induced a reconfiguration of plant metabolism. Specifically, microbial colonization predominantly instigated alterations in primary metabolism in roots, while in shoots, it primarily influenced defence metabolism. This highlighted the profound impact of microbial interactions on metabolic pathways of plants, shedding light on the intricate interplay between plants and their associated microbial communities.

Abstract Background Clostridium autoethanogenum is an acetogenic bacterium that autotrophically converts carbon monoxide (CO) and carbon dioxide (CO 2 ) gases into bioproducts and fuels via the Wood–Ljungdahl pathway (WLP). To facilitate overall carbon capture efficiency, the reaction stoichiometry requires supplementation of hydrogen at an increased ratio of H 2 :CO to maximize CO 2 utilization; however, the molecular details and thus the ability to understand the mechanism of this supplementation are largely unknown. Results In order to elucidate the microbial physiology and fermentation where at least 75% of the carbon in ethanol comes from CO 2 , we established controlled chemostats that facilitated a novel and high (11:1) H 2 :CO uptake ratio. We compared and contrasted proteomic and metabolomics profiles to replicate continuous stirred tank reactors (CSTRs) at the same growth rate from a lower (5:1) H 2 :CO condition where ~ 50% of the carbon in ethanol is derived from CO 2 . Our hypothesis was that major changes would be observed in the hydrogenases and/or redox-related proteins and the WLP to compensate for the elevated hydrogen feed gas. Our analyses did reveal protein abundance differences between the two conditions largely related to reduction–oxidation (redox) pathways and cofactor biosynthesis, but the changes were more minor than we would have expected. While the Wood–Ljungdahl pathway proteins remained consistent across the conditions, other post-translational regulatory processes, such as lysine-acetylation, were observed and appeared to be more important for fine-tuning this carbon metabolism pathway. Metabolomic analyses showed that the increase in H 2 :CO ratio drives the organism to higher carbon dioxide utilization resulting in lower carbon storages and accumulated fatty acid metabolite levels. Conclusions This research delves into the intricate dynamics of carbon fixation in C. autoethanogenum , examining the influence of highly elevated H 2 :CO ratios on metabolic processes and product outcomes. The study underscores the significance of optimizing gas feed composition for enhanced industrial efficiency, shedding light on potential mechanisms, such as post-translational modifications (PTMs), to fine-tune enzymatic activities and improve desired product yields.

Metabolic pathways are frequently transferred between bacterial strains in the environment through horizontal gene transfer (HGT), yet laboratory engineering to introduce new metabolic pathways often fails. Successful use of a pathway requires co-evolution of both pathway and host, and these interactions may be disrupted upon transfer to a new host. Here we show that two different pathways for catabolism of coumarate failed to function when initially transferred into Escherichia coli. Using laboratory evolution, we elucidated the factors limiting activity of the newly-acquired pathways and the modifications required to overcome these limitations. Both pathways required mutations to the host to enable effective growth with coumarate, but the necessary mutations differed depending on the chemistry and intermediates of the pathways. In one case, an intermediate inhibited purine nucleotide biosynthesis, and this inhibition was relieved by single amino acid mutations to IMP dehydrogenase. A strain that natively contains this coumarate catabolism pathway, Acinetobacter baumannii, is already resistant to inhibition by the relevant intermediate, suggesting that natural pathway transfers have faced and overcome similar challenges. These discoveries will aid in our understanding of HGT and ability to predictably engineer metabolism.

Gas fermentation by autotrophic bacteria, such as clostridia, offers a sustainable path to numerous bioproducts from a range of local, highly abundant, waste and low-cost feedstocks, such as industrial flue gases or syngas generated from biomass or municipal waste. Unfortunately, designing and engineering clostridia remains laborious and slow. The ability to prototype individual genetic parts, gene expression, and biosynthetic pathway performance in vitro before implementing them in cells could help address these bottlenecks by speeding up design. Unfortunately, a high-yielding cell-free gene expression (CFE) system from clostridia has yet to be developed. Here, we report the development and optimization of a high-yielding (236 ± 24 μg/mL) batch CFE platform from the industrially relevant anaerobe, Clostridium autoethanogenum. A key feature of the platform is that both circular and linear DNA templates can be applied directly to the CFE reaction to program protein synthesis. We demonstrate the ability to prototype gene expression, and quantitatively map cell-free metabolism in lysates from this system. We anticipate that the C. autoethanogenum CFE platform will not only expand the protein synthesis toolkit for synthetic biology, but also serve as a platform in expediting the screening and prototyping of gene regulatory elements in non-model, industrially relevant microbes.

Horizontal gene transfer (HGT) is a fundamental evolutionary process that plays a key role in bacterial evolution. The likelihood of a successful transfer event is expected to depend on the precise balance of costs and benefits resulting from pathway acquisition. Most experimental analyses of HGT have focused on phenotypes that have large fitness benefits under appropriate selective conditions, such as antibiotic resistance. However, many examples of HGT involve phenotypes that are predicted to provide smaller benefits, such as the ability to catabolize additional carbon sources. We have experimentally reproduced one such HGT event in the laboratory, studying the effects of transferring a pathway for catabolism of the plant-derived aromatic compound salicyl alcohol into soil isolates from the Pseudomonas genus. We find that pathway acquisition enables rapid catabolism of salicyl alcohol with only minor disruptions to existing metabolic and regulatory networks of the new host. However, this new catabolic potential does not confer a measurable fitness advantage during competitive growth in the rhizosphere. We conclude that the phenotype of salicyl alcohol catabolism is readily transferred by HGT but is selectively neutral under environmentally-relevant conditions. We propose that this condition is common and that HGT of many pathways will be self-limiting, because the selective benefits are small and negative frequency-dependent.