Abstract

 FhuA protein facilitates ligand-gated transport of ferrichrome-bound iron across Escherichia coli outer membranes. X-ray analysis at 2.7 Å resolution reveals two distinct conformations in the presence and absence of ferrichrome. The monomeric protein consists of a hollow, 22-stranded, antiparallel β barrel (residues 160–714), which is obstructed by a plug (residues 19–159). The binding site of ferrichrome, an aromatic pocket near the cell surface, undergoes minor changes upon association with the ligand. These are propagated and amplified across the plug, eventually resulting in substantially different protein conformations at the periplasmic face. Our findings reveal the mechanism of signal transmission and suggest how the energy-transducing TonB complex senses ligand binding.

Staphylococcus aureus Sav1866 is a bacterial homolog of the human ABC transporter Mdr1 that causes multidrug resistance in cancer cells. We report the crystal structure of Sav1866 in complex with adenosine‐5′‐(β,γ‐imido)triphosphate (AMP‐PNP) at 3.4 Å resolution and compare it with the previously determined structure of Sav1866 with bound ADP. Besides differences in the ATP‐binding sites, no significant conformational changes were observed. The results confirm that the ATP‐bound state of multidrug ABC transporters is coupled to an outward‐facing conformation of the transmembrane domains.

To transport or not to transport Therapeutic drug delivery into cells is complicated by membrane proteins like ABCB1 (also termed P-glycoprotein) that shuttle diverse compounds out of cells. Alam et al. determined high-resolution cryo–electron microscopy structures of ABCB1 bound either to a substrate, the cancer drug Taxol, or to the ABCB1 inhibitor zosuquidar. The conformational changes that facilitate drug transport are caused by hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP). The structures show that, although Taxol and zosquidar bind to the same site, subtle structural differences lead to altered conformations of the nucleotide binding domains that are responsible for ATP hydrolysis. Science , this issue p. 753

ABCG2 is a constitutively expressed ATP-binding cassette (ABC) transporter that protects many tissues against xenobiotic molecules. Its activity affects the pharmacokinetics of commonly used drugs and limits the delivery of therapeutics into tumour cells, thus contributing to multidrug resistance. Here we present the structure of human ABCG2 determined by cryo-electron microscopy, providing the first high-resolution insight into a human multidrug transporter. We visualize ABCG2 in complex with two antigen-binding fragments of the human-specific, inhibitory antibody 5D3 that recognizes extracellular loops of the transporter. We observe two cholesterol molecules bound in the multidrug-binding pocket that is located in a central, hydrophobic, inward-facing translocation pathway between the transmembrane domains. Combined with functional in vitro analyses, our results suggest a multidrug recognition and transport mechanism of ABCG2, rationalize disease-causing single nucleotide polymorphisms and the allosteric inhibition by the 5D3 antibody, and provide the structural basis of cholesterol recognition by other G-subfamily ABC transporters.

ABSTRACT ABCG2 is an ATP-binding cassette (ABC) transporter whose function affects the pharmacokinetics of drugs and contributes to multidrug resistance of cancer cells. While its interaction with the endogenous substrate estrone-3-sulfate (E 1 S) has been elucidated at a structural level, the recognition and recruitment of exogenous compounds is not understood at sufficiently high resolution. Here we present three cryo-EM structures of nanodisc-reconstituted, human ABCG2 bound to anticancer drugs tariquidar, topotecan and mitoxantrone. To enable structural insight at high resolution, we used Fab fragments of the ABCG2-specific monoclonal antibody 5D3, which binds to the external side of the transporter but does not interfere with drug-induced stimulation of ATPase activity. We observed that the binding pocket of ABCG2 can accommodate a single tariquidar molecule in a C-shaped conformation, similar to one of the two tariquidar molecules bound to ABCB1, where tariquidar acts as an inhibitor. We also found single copies of topotecan and mitoxantrone bound between key phenylalanine residues. Mutagenesis experiments confirmed the functional importance of two residues in the binding pocket, F439 and N436. Using 3D variability analyses, we found a correlation between substrate binding and reduced dynamics of the nucleotide binding domains (NBDs), suggesting a structural explanation for drug-induced ATPase stimulation. Our findings provide insight into how ABCG2 differentiates between inhibitors and substrates and may guide a rational design of new modulators and substrates.

Abstract Cellular uptake of vitamin B 12 in humans is mediated by the endocytosis of the B 12 carrier protein transcobalamin (TC) via its cognate cell surface receptor TCblR (or CD320), encoded by the CD320 gene(1). Because CD320 expression is associated with the cell cycle and upregulated in highly proliferating cells such as cancer cells(2–4), this uptake route is a potential target for cancer therapy(5). We developed and characterized four camelid nanobodies that bind TC or the interface of the TC:TCblR complex with nanomolar affinities. We determined X-ray crystal structures of all four nanobodies in complex with TC:TCblR, which enabled us to map their binding sites. When conjugated to a toxin, three of these nanobodies are capable of inhibiting the growth of HEK293T cells and therefore have the potential to inhibit the growth of human cancer cells. We visualized the cellular binding and endocytic uptake of the most potent nanobody (TCNB4) using fluorescent light microscopy. The co-crystal structures of TC:TCblR with another nanobody (TCNB34) revealed novel features of the interface of TC and the LDLR-A1 domain of TCblR. Our findings rationalize the structural basis for a decrease in affinity of TC-B 12 binding caused by the TCblR-Glu88 deletion mutant.

Abstract With conformation-specific nanobodies being used for a wide range of structural, biochemical, and cell biological applications, there is a demand for antigen-binding fragments (Fabs) that specifically and tightly bind these nanobodies without disturbing the nanobody-target protein interaction. Here we describe the development of a synthetic Fab (termed NabFab) that binds the scaffold of an alpaca-derived nanobody with picomolar affinity. We demonstrate that upon CDR grafting onto this parent nanobody scaffold, nanobodies recognizing diverse target proteins and derived from llama or camel can cross-react with NabFab without loss of affinity. Using NabFab as a fiducial and size enhancer (50 kDa), we determined the high-resolution cryo-EM structures of nanobody-bound VcNorM and ScaDMT, both small membrane proteins of ~50 kDa. Using an additional anti-Fab nanobody further facillitated reliable initial 3D structure determination from small cryo-EM test datasets. Given that NabFab is of synthetic origin, humanized, and can be conveniently expressed in E. coli in large amounts, it may not only be useful for structural biology, but also for biomedical applications.