Abstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) harbors a complex tumor microbiome that has been implicated in cancer progression and resistance to chemotherapy. Recent clinical investigations uncovered a correlation between high loads of intratumor Fusobacterium nucleatum and decreased patient survival. Here we show that healthy and cancerous pancreatic cell lines harboring intracellular F. nucleatum secrete increased levels of cancer-associated cytokines including GM-CSF, CXCL1, IL-8, and MIP-3α. We report that GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) secretion directly increases the proliferation and migration of pancreatic cancer cells via an autocrine mechanism, notably in the absence of immune cell participation. Furthermore, we show that non-cancerous pancreatic epithelial cells do not exhibit increased proliferation or migration in response to these cytokines, but nevertheless, their secreted cytokines stimulate these responses in cancerous cell lines through paracrine signaling. Our results provide evidence that intratumor F. nucleatum in the pancreas elicits an infection-specific cytokine secretion profile from both normal and cancerous cells that adversely contributes to cancer progression through autocrine and paracrine mechanisms. Therefore, these results support the importance of investigating the contributions of both microbiome and host driven processes in pancreatic cancer to guide future therapeutic interventions.

ABSTRACT The ubiquitous skin colonist Staphylococcus epidermidis elicits a CD8 + T cell response pre-emptively, in the absence of an infection 1 . However, the scope and purpose of this anti-commensal immune program are not well defined, limiting our ability to harness it therapeutically. Here, we show that this colonist also induces a potent, durable, and specific antibody response that is conserved in humans and non-human primates. A series of S. epidermidis cell-wall mutants revealed that the cell surface protein Aap is a predominant target. By colonizing mice with a strain of S. epidermidis in which the parallel β-helix domain of Aap is replaced by tetanus toxin fragment C, we elicit a potent neutralizing antibody response that protects mice against a lethal challenge. A similar strain of S. epidermidis expressing an Aap-SpyCatcher chimera can be conjugated with recombinant immunogens; the resulting labeled commensal elicits high titers of antibody under conditions of physiologic colonization, including a robust IgA response in the nasal mucosa. Thus, immunity to a common skin colonist involves a coordinated T and B cell response, the latter of which can be redirected against pathogens as a novel form of topical vaccination.

ABSTRACT Many bacterial species naturally take up DNA from their surroundings and recombine it into their chromosome through homologous gene transfer (HGT) to aid in survival and gain advantageous functions. Herein we present the first characterization of Type 4 pili mediated natural competence in Fusobacterium nucleatum , which are Gram-negative, anaerobic bacteria that participate in a range of infections and diseases including periodontitis, preterm birth, and cancer. We bioinformatically identified components of the Type 4 conjugal pilus machinery and show this is a conserved system within the Fusobacterium genus. We next validate Type 4 pili in natural competence in F. nucleatum strain 23726 and show that gene deletions in key components of pilus deployment ( pilQ) and cytoplasmic DNA import ( comEC) abolish DNA uptake and chromosomal incorporation. We next show that natural competence may require native F. nucleatum DNA methylation to bypass restriction modification systems and allow subsequent genomic homologous recombination. In summary, this proof of principle study provides the first characterization of natural competence in Fusobacterium nucleatum and highlights the potential to exploit this DNA import mechanism as a genetic tool to characterize virulence mechanisms of an opportunistic oral pathogen.

Abstract The skin microbiome plays a pivotal role in the production of attractive cues detected by mosquitoes. Here we leveraged recent advances in genetic engineering to significantly reduce the production of L-(+)-lactic acid as a strategy to reduce mosquito attraction to the highly prominent skin commensals Staphylococcus epidermidis and Corynebacterium amycolatum . Engraftment of these engineered bacteria onto the skin of mice reduced mosquito attraction and feeding for up to 11 uninterrupted days, which is considerably longer than the several hours of protection conferred by the leading chemical repellent DEET. Taken together, our findings demonstrate engineering the skin microbiome to reduce attractive volatiles represents an innovative untapped strategy to reduce vector attraction, preventing bites, and pathogen transmission setting the stage for new classes of long-lasting microbiome-based repellent products. One-Sentence Summary Modified microbes make skin less attractive to mosquitoes

Abstract The skin microbiome plays a pivotal role in the production of attractive cues detected by mosquitoes. Here, we leveraged recent advances in genetic engineering to significantly reduce the production of L-(+)-lactic acid as a strategy to reduce mosquito attraction to the highly prominent skin commensals Staphylococcus epidermidis and Corynebacterium amycolatum. Engraftment of these engineered bacteria onto the skin of mice reduced mosquito attraction and feeding for up to 11 uninterrupted days, which is considerably longer than the several hours of protection conferred by the leading chemical repellent N,N-diethyl-meta-toluamide. Taken together, our findings demonstrate engineering the skin microbiome to reduce attractive volatiles represents an innovative untapped strategy to reduce vector attraction, preventing bites, and pathogen transmission. These findings set the stage for new classes of long-lasting microbiome-based repellent products.

ABSTRACT Bacterial restriction-modification (R-M) systems are a first line immune defense against foreign DNA from viruses and other bacteria. While R-M systems are critical in maintaining genome integrity, R-M nucleases unfortunately present significant barriers to targeted genetic modification. Bacteria of the genus Fusobacterium are oral, Gram-negative, anaerobic, opportunistic pathogens that are implicated in the progression and severity of multiple cancers and tissue infections, yet our understanding of their direct roles in disease have been severely hindered by their genetic recalcitrance. Here, we demonstrate a path to overcome these barriers in Fusobacterium by using native DNA methylation as a host mimicry strategy to bypass R-M system cleavage of user introduced plasmid DNA. We report the identification, characterization, and successful use of Fusobacterium nucleatum ( Fn ) Type II and III DNA methyltransferase (DMTase) enzymes to produce a multi-fold increase in gene knockout efficiency in the strain Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum 23726 ( Fnn 23726), as well as the first efficient gene knockouts and complementations in Fnn 25586. We show plasmid protection can be accomplished in vitro with purified enzymes, as well as in vivo in an E. coli host that constitutively expresses Fnn DMTase enzymes. By characterizing specific DMTases that are critical for bypassing R-M systems, we have enhanced our understanding of potential enzyme combinations, with the goal of expanding these studies to genetically modify clinical isolates of Fusobacterium that have thus far been inaccessible to molecular characterization. This proof-of-concept study provides a roadmap to guide molecular microbiology efforts of the scientific community to facilitate the discovery of new Fusobacterium virulence genes, thereby leading to a new era of characterizing how an oral opportunistic pathogen contributes to an array of human infections and diseases. IMPORTANCE Fusobacterium nucleatum is an oral opportunistic pathogen associated with diseases including cancer and preterm birth. Our understanding of how this bacterium modulates human disease has been hindered by a lack of genetic systems. Here we show that F. nucleatum DNA methyltransferase modified plasmid DNA overcomes the transformation barrier and allows the development of genetic systems in previously inaccessible strains. We present a strategy that can be expanded to enable the genetic modification of clinical isolates, thereby fostering investigational studies to uncover novel host-pathogen interactions in Fusobacterium .