A physical map has been constructed of the human genome containing 15,086 sequence-tagged sites (STSs), with an average spacing of 199 kilobases. The project involved assembly of a radiation hybrid map of the human genome containing 6193 loci and incorporated a genetic linkage map of the human genome containing 5264 loci. This information was combined with the results of STS-content screening of 10,850 loci against a yeast artificial chromosome library to produce an integrated map, anchored by the radiation hybrid and genetic maps. The map provides radiation hybrid coverage of 99 percent and physical coverage of 94 percent of the human genome. The map also represents an early step in an international project to generate a transcript map of the human genome, with more than 3235 expressed sequences localized. The STSs in the map provide a scaffold for initiating large-scale sequencing of the human genome.

We executed a genome-wide association scan for age-related macular degeneration (AMD) in 2,157 cases and 1,150 controls. Our results validate AMD susceptibility loci near CFH ( P < 10 −75 ), ARMS2 ( P < 10 −59 ), C2/CFB ( P < 10 −20 ), C3 ( P < 10 −9 ), and CFI ( P < 10 −6 ). We compared our top findings with the Tufts/Massachusetts General Hospital genome-wide association study of advanced AMD (821 cases, 1,709 controls) and genotyped 30 promising markers in additional individuals (up to 7,749 cases and 4,625 controls). With these data, we identified a susceptibility locus near TIMP3 (overall P = 1.1 × 10 −11 ), a metalloproteinase involved in degradation of the extracellular matrix and previously implicated in early-onset maculopathy. In addition, our data revealed strong association signals with alleles at two loci ( LIPC , P = 1.3 × 10 −7 ; CETP , P = 7.4 × 10 −7 ) that were previously associated with high-density lipoprotein cholesterol (HDL-c) levels in blood. Consistent with the hypothesis that HDL metabolism is associated with AMD pathogenesis, we also observed association with AMD of HDL-c—associated alleles near LPL ( P = 3.0 × 10 −3 ) and ABCA1 ( P = 5.6 × 10 −4 ). Multilocus analysis including all susceptibility loci showed that 329 of 331 individuals (99%) with the highest-risk genotypes were cases, and 85% of these had advanced AMD. Our studies extend the catalog of AMD associated loci, help identify individuals at high risk of disease, and provide clues about underlying cellular pathways that should eventually lead to new therapies.

Background BAP1 has been shown to be a target of both somatic alteration in high-risk ocular melanomas (OM) and germline inactivation in a few individuals from cancer-prone families. These findings suggest that constitutional BAP1 changes may predispose individuals to metastatic OM and that familial permeation of deleterious alleles could delineate a new cancer syndrome. Design To characterize BAP1's contribution to melanoma risk, we sequenced BAP1 in a set of 100 patients with OM, including 50 metastatic OM cases and 50 matched non-metastatic OM controls, and 200 individuals with cutaneous melanoma (CM) including 7 CM patients from CM-OM families and 193 CM patients from CM-non-OM kindreds. Results Germline BAP1 mutations were detected in 4/50 patients with metastatic OM and 0/50 cases of non-metastatic OM (8% vs. 0%, p = 0.059). Since 2/4 of the BAP1 carriers reported a family history of CM, we analyzed 200 additional hereditary CM patients and found mutations in 2/7 CM probands from CM-OM families and 1/193 probands from CM-non-OM kindreds (29% vs. 0.52%, p = .003). Germline mutations co-segregated with both CM and OM phenotypes and were associated with the presence of unique nevoid melanomas and highly atypical nevoid melanoma-like melanocytic proliferations (NEMMPs). Interestingly, 7/14 germline variants identified to date reside in C-terminus suggesting that the BRCA1 binding domain is important in cancer predisposition. Conclusion Germline BAP1 mutations are associated with a more aggressive OM phenotype and a recurrent phenotypic complex of cutaneous/ocular melanoma, atypical melanocytic proliferations and other internal neoplasms (ie. COMMON syndrome), which could be a useful clinical marker for constitutive BAP1 inactivation.

Abstract Multiomic profiling of single cells by sequencing is a powerful technique for investigating cellular diversity in complex biological systems. Although the existing droplet-based microfluidic methods have advanced single-cell sequencing, they produce a plethora of cell-free droplets and underutilize barcoding capacities due to their low cell concentration prerequisites. Meanwhile, combinatorial indexing on microplates can index cells in a more effective way; however, it requires time-consuming and laborious protocols involving multiple splitting and pooling steps. Addressing these constraints, we have developed “Overloading And unpacKing” (OAK). With reduced labor intensity, OAK can provide cost-effective multiomic profiling for hundreds of thousands of cells, offering detection sensitivity on par with commercial droplet-based methods. To demonstrate OAK’s versatility, we conducted single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) as well as joint single-nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) and single-nucleus Assay for Transposase Accessible Chromatin with sequencing (snATAC-Seq) using cell lines. We further showcased OAK’s performance on more complex samples, including in vitro differentiated bronchial epithelial cells and primary retinal tissues. Finally, we examined transcriptomic responses of 408,000 melanoma cells across around 1,000 starting lineages over a 90-day treatment with a RAF inhibitor, belvarafenib. We discovered a rare cell population (0.12%) that underwent a sequence of transcriptomic changes, resulting in belvarafenib resistance. Ultra-high throughput, broad compatibility with diverse molecular modalities, high detection sensitivity, and simplified experimental procedures distinguish OAK from previous methods, and render OAK a powerful tool for large-scale analysis of molecular signatures, even for rare cells.

Abstract Age-related macular degeneration (AMD) is a complex neurodegenerative disease and is the leading cause of blindness in the aging population. Early AMD is characterized by drusen in the macula and causes minimal changes in visual function. The later stages are responsible for the majority of visual impairment and blindness and can be either manifest as geographic atrophy (dry) or neovascular disease (wet). Available medicines are directed against the wet form and do not cure vision loss. Therefore, it is imperative to identify preventive and therapeutic targets. As the mechanism for AMD is unclear, we aim to interrogate the disease-affected tissue - the macular neural retina and macular retina pigment epithelium (RPE)/choroid. We investigated differentially expressed genes expression (DEG) across the clinical stages of AMD in meticulously dissected and phenotyped eyes using a standardized published protocol (Owen et al., 2019). Donor eyes (n=27) were obtained from Caucasian individuals with an age range of 60-94 and 63% were male, and tissue from the macula RPE/choroid and macula neural retina were taken from the same eye. Donor eyes were recovered within 6 hours post mortem interval time to ensure maximal preservation of RNA quality and accuracy of diagnosis. Eyes were then phenotyped by retina experts using multi modal imaging (fundus photos and SD-OCT). Utilizing DESeq2, followed PCA, Benjamini Hochberg adjustment to control for the false discovery rate, and Bonferonni correction for the number of paired comparisons: a total of 26,650 genes were expressed in the macula RPE/choroid and/or macula retina among which significant differential expression was found for 1,204 genes between neovascular AMD and normal eyes, 40 genes between intermediate AMD and normal eyes, and 1,194 genes between intermediate AMD and neovascular AMD. A comparison of intermediate AMD versus normal eyes included TCN2, PON1, IFI6, GPR123, and TIMD4 as being some of the most significant DEGs in the macula RPE/choroid. A comparison of neovascular AMD versus normal eyes included SLC1A2, SLC24A1, SCAMP5, PTPRN, and SEMA7A as being some of the most significant DEGs in the macula RPE/choroid. Top pathways of DEGs in the macular RPE/choroid identified through Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for the comparison of intermediate AMD with normal eyes were interferon signaling and Th1 and Th2 activation, while those for the comparison of neovascular AMD with normal eyes were the phototransduction and SNARE signaling pathways. Allele-specific expression (ASE) in coding regions of previously reported AMD risk loci identified by GWAS (Fritsche et al, 2016) revealed significant ASEs for C3 rs2230199 and CFH rs1061170 in the macula RPE/choroid for normal eyes and intermediate AMD, and for CFH rs1061147 in the macula RPE/choroid for normal eyes and intermediate and neovascular AMD. An investigation of the 34 established AMD risk loci revealed that 75% of them were significantly differentially expressed between normal macular RPE/choroid and macular neural retina, with 75% of these loci showing higher expression in the RPE. Similarly, disease state differences for the GWAS loci were only found to be statistically differentially expressed in the macular RPE/choroid. Moreover, the known coding variants in the previously identified GWAS loci including, CFH , C3 , CFB , demonstrated ASE across AMD clinical stages in the macular RPE/choroid and not in the neural retina. These data at the bulk level underscore the importance of the RPE/choroid to AMD pathophysiology. While many bulk RNASeq data sets are publicly available, to the best of our knowledge this is one of the first publicly available datasets with both maculae RPE/choroid and macula neural retina from the same well phenotyped donor eye(s) where the macula is separated from the periphery. Our findings also underscore the importance of studying both macular tissue types to gain a full understanding of mechanisms leading to AMD. Our results provide insights into underlying biological mechanisms that may differentiate the disease subtypes and into the tissues affected by the disease.

Abstract Usher syndrome (USH) is the most common form of hereditary deafness-blindness in humans. USH is a complex genetic disorder, assigned to three clinical subtypes differing in onset, course, and severity, with USH1 being the most severe. Rodent USH1 models do not reflect the ocular phenotype observed in human patients to date; hence, little is known about the pathophysiology of USH1 in the human eye. One of the USH1 genes, USH1C , exhibits extensive alternative splicing and encodes numerous harmonin protein isoforms that function as scaffolds for organizing the USH interactome. RNA-seq analysis of human retinas uncovered harmonin_a1 as the most abundant transcript of USH1C . Bulk RNA-seq analysis and immunoblotting showed abundant expression of harmonin in Müller glia cells (MGCs) and retinal neurons. Furthermore, harmonin was localized in the terminal endfeet and apical microvilli of MGCs, presynaptic region (pedicle) of cones, and outer segments of rods as well as at adhesive junctions of MGCs and photoreceptors in the outer limiting membrane (OLM). Our data provide evidence for the interactions of harmonin with OLM molecules in photoreceptors (PRCs) and MGCs and rhodopsin in PRCs. Subcellular expression and colocalization of harmonin correlate with the clinical phenotype observed in USH1C patients. In addition, primary cilia defects in USH1C patient-derived fibroblasts could be reverted by the delivery of harmonin_a1 transcript isoform. Our data provide novel insights into PRC cell biology, USH1C pathophysiology, and for developing gene therapy treatment.

Abstract Background Systematic characterization of how genetic variation modulates gene regulation in a cell type specific context is essential for understanding complex traits. To address this question, we profiled gene expression and chromatin state of cells from healthy retinae of 20 human donors with a single-cell multiomics approach, and performed genomic sequencing. Results We mapped single-cell eQTL (sc-eQTLs), single-cell caQTL (sc-caQTL), single-cell allelic specific chromatin accessibility (sc-ASCA) and single-cell allelic specific expression (sc-ASE) in major retinal cell types. By integrating these results, we identified and characterized regulatory elements and genetic variants effective on gene regulation in individual cell types. Most of the sc-eQTLs and sc-caQTLs identified show cell type specific effects, while the cis-elements containing the genetic variants with cell type specific effects tend to be accessible in multiple cell types. Furthermore, the transcription factors with binding sites perturbed by genetic variants tend to have higher expression in the cell types, where the variants have effect, than the cell types where the variants do not have effect. Finally, we identified the enriched cell types, candidate causal variants and genes, and cell type specific regulatory mechanism underlying GWAS loci. Conclusions Overall, genetic effects on gene regulation are highly context dependent. Our results suggest that among cell types sharing a similar lineage, cell type dependent genetic effect is primarily driven by trans-factors rather than cell type specific chromatin state of cis-elements. Our findings indicate a role for hierarchical transcription factors collaboration in cell type specific effects of genetic variants on gene regulation.

When thinking about major health concerns in the U.S. and around the world, eye care ranks lower compared to cardiovascular disease, cancer, and diabetes. However, people do not think about the direct connection between diabetes and eye health. Untreated diabetes can lead to visual impairments such as blindness or difficulty seeing. Studies have found that eye health associated with nutrition, occupational exposure, diabetes, high blood pressure, and heart disease are some of the known risk factors. This study aimed to identify the potential risk factors that are associated with visual impairment (VI). The data used for this analysis were obtained from the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) - Behavioral Risk Factor Surveillance System (BRFSS) from 2018 to 2021. We found important characteristics, such as the U.S. region, general health perception, employment status, income status, age, and health insurance source, that are associated with VI. Our study confirmed that the common demographical factors including age, race/ethnicity, the U.S. region, and gender are associated with VI. The study also highlights associations with additional risk factors such as health insurance source, general health perceptions, employment status, and income status. Using this information, we can reach out to communities with large numbers of individuals experiencing vision challenges and help educate them on prevention and treatment protocols, thereby effectively addressing VI and blindness challenges within our communities, neighborhoods, and finally, the broader society.

We introduce a novel deconvolution framework, DeMixSC, to resolve technological discrepancies between bulk and single-cell/nucleus RNA-seq data, a critical issue unaddressed by existing single-cell-based deconvolution methods. Built upon the weighted non-negative least squares framework, DeMixSC introduces two key improvements: it leverages a small benchmark dataset to identify and rescale genes affected by technological discrepancies; it employs a novel weight function to account for variations across subjects and cells. The advanced utility of DeMixSC is demonstrated by its superior deconvolution accuracy on a benchmark dataset of healthy retinas and its broad applicability to a large aged-macular degeneration (AMD) cohort. Our work is the first to systematically evaluate the impact of technological discrepancies on deconvolution performance and underscores the importance of using a benchmark dataset to counteract these discrepancies. Our study positions DeMixSC as a transferable tool for accurate deconvolution of large bulk RNA-seq cohorts, necessitating only a tissue-type match between the benchmark and targeted datasets.