ABSTRACT Estrogen receptor (ER) plays important roles in regulating normal development and female reproductive system function. Loss of ER pathway activity is a hallmark of breast cancer progression, associated with accelerated tumor proliferation and resistance to endocrine therapy. How ER loss occurs remains poorly understood. Here, we show that serine starvation, a metabolic stress often found in solid tumors, downregulates estrogen receptor alpha (ERα) expression, represses transcriptional targets such as progesterone receptor (PR), and reduces sensitivity to antiestrogens, suggesting a transition of ER-positive (ER + ) breast cancer cells to an ER/PR-negative (ER - /PR - ) state. ER downregulation under serine starvation is accompanied by a global loss of histone acetylation. These chromatin changes are driven by metabolic reprogramming triggered by serine starvation, particularly lower glucose flux through glycolysis and the TCA cycle, leading to reduced acetyl-CoA levels and histone hypoacetylation. Supplementation with acetate or glycerol triacetate (GTA), precursors of acetyl-CoA, restores H3K27 acetylation and ERα expression under serine starvation. Therefore, a major consequence of serine starvation in breast cancer could be global chromatin changes that influence lineage-specific gene expression.

Neuroblastoma is a leading cause of death in childhood cancer cases. Unlike adult malignancies, which typically develop from aged cells through accumulated damage and mutagenesis, neuroblastoma originates from neural crest cells with disrupted differentiation. This distinct feature provides novel therapeutic opportunities beyond conventional cytotoxic methods. Previously, we reported that the mitochondrial uncoupler NEN (niclosamide ethanolamine) activated mitochondria respiration to reprogram the epigenome, promoting neuronal differentiation. In the current study, we further combine NEN with retinoic acid (RA) to promote neural differentiation both in vitro and in vivo. The treatment increased the expression of RA signaling and neuron differentiation-related genes, resulting in a global shift in the transcriptome towards a more favorable prognosis. Overall, these results suggest that the combination of a mitochondrial uncoupler and the differentiation agent RA is a promising therapeutic strategy for neuroblastoma.

One-Sentence Summary Raf1 is present within the mitochondrial matrix, where it binds GLS to regulate glutamine catabolism and tumorigenesis. In cancer, Raf1 activation occurs via mechanisms that include mutation of upstream regulators, such as receptor tyrosine kinases and Ras GTPases, as well as by mutations that affect RAF1 itself, including via gene amplification ( 1 – 4 ). Once recruited to the plasma membrane ( PM ) Raf1 can engage downstream mitogen-activated protein kinase ( MAPK ) pathway signaling through phosphorylation of the MEK kinases ( 5 ). In addition to Raf1, A-Raf and B-Raf can also activate MEK and these other two Raf isoforms can compensate for MAPK activation in the event of Raf1 loss ( 6 , 7 ). Despite this, Raf1 remains essential for the development and maintenance of some tumors through mechanisms independent of MAPK activity ( 7 , 8 ). In this regard, Raf1 has well-described interactions outside the canonical MAPK pathway, including several with outer mitochondrial membrane ( OMM ) proteins ( 9 , 10 ), although Raf1 has not been previously identified inside mitochondria. Mitochondria comprise a hub for various metabolic processes modulated in cancer cells to accommodate rapid proliferation. One such process is glutaminolysis, which involves the catabolism of glutamine to generate both ATP as well as precursors for the synthesis of fatty acids, nucleotides, and nonessential amino acids ( 11 – 13 ). Glutaminase ( GLS ) proteins, which catalyze the first and rate-limiting step of this process by converting glutamine to glutamate, are often upregulated in cancer ( 14 – 16 ). GLS activation has been previously associated with tumors driven by Ras, upstream regulators of Raf kinases ( 13 , 17 ). Here we identify Raf1 protein inside mitochondria where Raf1 associates with GLS in the mitochondrial matrix to enable glutamine catabolism and tumorigenic growth. Raf kinases play vital roles in normal mitogenic signaling and cancer, however, the identities of functionally important Raf-proximal proteins throughout the cell are not fully known. Raf1 proximity proteomics/BioID in Raf1-dependent cancer cells unexpectedly identified Raf1-adjacent proteins known to reside in the mitochondrial matrix. Inner-mitochondrial localization of Raf1 was confirmed by mitochondrial purification and super-resolution microscopy. Inside mitochondria, Raf1 associated with glutaminase (GLS) in diverse human cancers and enabled glutaminolysis, an important source of biosynthetic precursors in cancer. These impacts required Raf1 kinase activity and were independent of canonical MAP kinase pathway signaling. Kinase-dead mitochondrial matrix-localized Raf1 impaired glutaminolysis and tumorigenesis in vivo. These data indicate that Raf1 localizes inside mitochondria where it interacts with GLS to engage glutamine catabolism and support tumorigenesis.

Abstract Adult salivary stem/progenitor cells (SSPC) have an intrinsic property to self-renew in order to maintain tissue architecture and homeostasis. Adult salivary glands have been documented to harbor SSPC, which have been shown to play a vital role in the regeneration of the glandular structures post radiation damage. We have previously demonstrated that activation of aldehyde dehydrogenase 3A1 (ALDH3A1) after radiation reduced aldehyde accumulation in SSPC, leading to less apoptosis and improved salivary function. We subsequently found that sustained pharmacological ALDH3A1 activation is critical to enhance regeneration of murine submandibular gland after radiation damage. Further investigation shows that ALDH3A1 function is crucial for SSPC self-renewal and differentiation even in the absence of radiation stress. Salivary glands from Aldh3a1 -null mice have fewer acinar structures than wildtype mice. ALDH3A1 deletion or pharmacological inhibition in SSPC leads to a decrease in mitochondrial DNA copy number, lower expression of mitochondrial specific genes and proteins, structural abnormalities, lower membrane potential, and reduced cellular respiration. Loss or inhibition of ALDH3A1 also elevates ROS levels and accumulation of ALDH3A1 substrate 4-hydroxynonenal (4-HNE, a lipid peroxidation product), leading to decreased survival of murine SSPC that can be rescued by treatment with 4-HNE specific carbonyl scavengers. Our data indicate that ALDH3A1 activity protects mitochondrial function and is important for the development and regeneration activity of SSPC. This knowledge will help to guide our translational strategy of applying ALDH3A1 activators in the clinic to prevent radiation-related hyposalivation in head and neck cancer patients.