Tests that infer the ancestral origin of a DNA sample have considerable potential in the development of forensic tools that can help to guide crime investigation. We have developed a single-tube 34-plex SNP assay for the assignment of ancestral origin by choosing ancestry-informative markers (AIMs) exhibiting highly contrasting allele frequency distributions between the three major population-groups. To predict ancestral origin from the profiles obtained, a classification algorithm was developed based on maximum likelihood. Sampling of two populations each from African, European and East Asian groups provided training sets for the algorithm and this was tested using the CEPH Human Genome Diversity Panel. We detected negligible theoretical and practical error for assignments to one of the three groups analyzed with consistently high classification probabilities, even when using reduced subsets of SNPs. This study shows that by choosing SNPs exhibiting marked allele frequency differences between population-groups a practical forensic test for assigning the most likely ancestry can be achieved from a single multiplexed assay.

Elevated temperatures during early developmental stages play a pivotal role in the fate of the final sexual phenotype of fish populations, particularly towards male-skewed sex ratios . This is the case with European sea bass (Dicentrarchus labrax), one of the most important European species in the aquaculture industry. To unveil informative markers of the past thermal events, we investigated changes in the miRNome within the gonads of this species. Consequently, we exposed European sea bass to elevated temperatures during early development and conducted miRNA-sequencing analysis in the ovaries and testes one year post-heat treatment. The examination of miRNA expression levels identified three and twelve miRNAs in ovaries and testes, respectively, reflecting past thermal events. To assess the evolutionary conservation of these identified miRNAs in gonads, we cross-referenced our data with miRNome public information from ovaries and testes in nine additional fish species. This analysis uncovered 43 potential sex-biased markers present in at least five studied species along the evolutionary timeline. For instance, miR-155, miR-429, and miR-140 were female-skewed while miR-184, miR-499, and miR-135 were male-skewed. In addition, among these markers, eight conserved sex-skewed miRNAs proved informative regarding past thermal events in both the ovaries (e.g., miR-192-5p and miR-143-3p) and testes (miR-129-5p, miR-2187a-3p, miR-724-5p, miR-143-3p, miR-194a-5p and miR-223-3p). Notably, miR-223-3p and miR-194a-5p were conserved female-skewed, but showed upregulation in males exposed to high temperature. These miRNAs could serve as markers of heat-induced masculinization of genetic female-prone fish. The current research broadens the inventory of sex-specific miRNAs along evolution in fish and, elucidates thermosensitive miRNAs in the gonads. These findings hold promise as potential tools for predicting historical environmental events associated with masculinization due to high-temperature treatments in cultured species but also perhaps for natural populations exposed to a climate change scenario.

Abstract MicroRNAs (miRNAs) are important post-transcriptional regulators of gene expression in a wide variety of physiological processes, including those related to the reproductive system. Although in the last decade a plethora of miRNAs has been reported, the miRNA alterations occurred by environmental cues and their biological functions have not yet been elucidated. With the aim to identify epigenetic regulations mediated by miRNAs in the gonads in a climate change scenario, zebrafish ( Danio rerio ) were subjected to high temperatures during sex differentiation (18-32 days post fertilization, dpf), a treatment that results in male-skewed sex ratios. Once the fish reached adulthood (90 dpf), ovaries and testes were sequenced by high-throughput technologies. About 101 million high-quality reads were obtained from gonadal samples. Analyses of the expression levels of the miRNAs identified a total of 23 and 1 differentially expressed (DE) miRNAs in ovaries and testes, respectively, two months after the heat treatment. Most of the identified miRNAs were involved in human sex-related cancer. After retrieving 3’ UTR regions, ~400 predicted targets of the 24 DE miRNAs were obtained, some with reproduction-related functions. Their synteny in the zebrafish genome was, for more than half of them, in the chromosomes 7, 2, 4, 3 and 11 in the ovaries, chromosome 4 being the place where the predicted sex-associated-region ( sar ) is localized in wild zebrafish. Further, spatial localization in the gonads of two selected miRNAs (miR-122-5p and miR-146-5p) showed exclusive expression in the ovarian germ cells. The present study expands the catalog of sex-specific miRNAs and deciphers, for the first time, thermosensitive miRNAs in the zebrafish gonads that might be used as potential epimarkers to predict environmental past events.