Abstract Klinefelter syndrome (47,XXY) causes infertility with a testicular histology comprising two types of Sertoli cell-only tubules, representing mature and immature-like Sertoli cells, and occasionally focal spermatogenesis. Here, we show that the immature-like Sertoli cells highly expressed XIST and had two X-chromosomes, while the mature Sertoli cells lacked XIST expression and had only one X-chromosome. Sertoli cells supporting focal spermatogenesis also lacked XIST expression and the additional X-chromosome, while the spermatogonia expressed XIST despite having only one X-chromosome. XIST was expressed in Sertoli cells until puberty, where a gradual loss was observed. Our results suggest that a micro-mosaic loss of the additional X-chromosome is needed for Sertoli cells to mature and to allow focal spermatogenesis.

ABSTRACT Although the impact of gender-affirming hormone therapy (GAHT) on spermatogenesis in trans women has already been studied, data on its precise effects on the testicular environment is poor. Therefore, this study aimed to characterize, through histological and transcriptomic analysis, the spermatogonial stem cell niche of 106 trans women who underwent standardized GAHT, comprising estrogens and cyproterone acetate. A partial dedifferentiation of Sertoli cells was observed, marked by the co-expression of androgen receptor and anti-Müllerian hormone which mirrors the situation in peripubertal boys. The Leydig cells also exhibited a distribution analogous to peripubertal tissue, accompanied by a reduced insulin-like factor 3 expression. Although most peritubular myoid cells expressed alpha-smooth muscle actin 2, the expression pattern was disturbed. Besides this, fibrosis was particularly evident in the tubular wall and the lumen was collapsing in most participants. A spermatogenic arrest was also observed in all participants. The transcriptomic profile of transgender tissue confirmed a loss of mature characteristics - a partial rejuvenation - of the spermatogonial stem cell niche and, in addition, detected inflammation processes occurring in the samples. The present study shows that GAHT changes the spermatogonial stem cell niche by partially rejuvenating the somatic cells and inducing fibrotic processes. These findings are important to further understand how estrogens and testosterone suppression affect the testis environment, and in the case of orchidectomized testes as medical waste material, their potential use in research.

ABSTRACT The aim of the study is to investigate testicular mosaicism in non-mosaic postpubertal Klinefelter Syndrome patients and in non-mosaic prepubertal Klinefelter boys Testes of the males with non-mosaic Klinefelter Syndrome at different developmental stages were used. Immunohistochemical and fluorescent in situ hybridization analyses were applied for X chromosome ploidy in testis-specific cells in testicular biopsy samples from non-mosaic Klinefelter Syndrome patients. According to our findings, all analyzed spermatogonia in both postpubertal and prepubertal non-mosaic Klinefelter Syndrome patients have a 46,XY karyotype. However, while the Sertoli cells surrounding spermatogonia in postpubertal samples also have a 46,XY karyotype, the Sertoli cells surrounding spermatogonia in prepubertal samples have a 47,XXY karyotype. Peritubular myoid cells and Leydig cells may also have mosaicism in both postpubertal patients and prepubertal boys. In conclusion, we confirmed in situ using cell-specific markers that testicular mosaicism exists in non-mosaic Klinefelter Syndrome patients. Therefore, we hypothesize that focal spermatogenesis seen in some postpubertal Klinefelter Syndrome patients originates from euploid spermatogonia and Sertoli cells. Additionally, our findings suggest that only spermatogonia that have lost their X chromosome can survive. Furthermore, our data suggest that spermatogonia lose the extra X chromosome during fetal or neonatal life, while Sertoli cells lose it around puberty. These findings will lay the groundwork for new studies on exactly when and by which mechanism an extra X chromosome is lost in spermatogonia and Sertoli cells.

This study presents a biphasic approach to overcome the limitations of current testicular organoid (TO) cultures, including histological heterogeneity, germ cell loss and absence of spermatogenesis. Agarose microwells were utilized to create TOs from prepubertal C57BL/6J testicular cells. First emphasis was on improving germ cell survival during the initial 2-week reorganization phase by comparing α-MEM + 10% KSR medium, known to support TO generation in mice, to three optimized media (1-3). Cell densities and culture dynamics were also tested to recreate histological resemblance to testes.  After optimizing germ cell survival and cell organization, the effect of growth factors and immunomodulation through CD45+ immune cell depletion or dexamethasone (DEX) supplementation were assessed for enhancing spermatogenesis during the subsequent differentiation phase. Testicular cells self-reorganized into organoids resembling the testicular anatomical unit, characterized by one tubule-like structure surrounded by interstitium. Media 1 3 proved superior for organoid growth during the reorganization phase, with TOs in medium 3 exhibiting germ cell numbers (7.4 ± 4.8%) comparable to controls (9.3 ± 5.3%). Additionally, 37 ± 30% demonstrated organized histology from 32 × 103 cells under static conditions. Switching to α-MEM + 10% KSR during the differentiation phase increased formation efficiency to 85 ± 7%, along with elevated germ cell numbers, testosterone production (3.1 ± 0.9 ng/mL) and generation of γH2AX+ spermatid-like cells (steps 8-11, 1.2 ± 2.2% of the total). Adding differentiation factors to the α-MEM increased spermatid-like cell numbers to 2.9 ± 5.9%, confirmed through positive staining for CREM, TP1, and PNA. Although, these remained diploid with irregular nuclear maturation. DEX supplementation had no additional effect, and immune cell depletion adversely impacted TO formation.  The manipulability of TOs offers advantages in studying male infertility and exploring therapies, with scalability enabling high-throughput chemical screening and reducing animal usage in reproductive toxicity and drug discovery studies.

Abstract Klinefelter syndrome (47,XXY) causes infertility with a testicular histology comprising two types of Sertoli cell-only tubules, representing mature and immature-like Sertoli cells, and occasionally focal spermatogenesis. Here, we show that the immature Sertoli cells highly expressed XIST and have two X-chromosomes, while the mature Sertoli cells lack XIST expression and have only one X-chromosome. Sertoli cells supporting focal spermatogenesis also lack XIST expression and the additional X-chromosome, while the spermatogonia expressed XIST despite having only one X-chromosome. XIST was expressed in Sertoli cells until puberty, where a gradual loss was observed. Our results suggest that a micro-mosaic loss of the additional X-chromosome is needed for Sertoli cells to mature and to allow focal spermatogenesis.