Abstract Next-generation sequencing has led to a dramatic improvement in molecular diagnoses of serious pediatric disorders caused by apparently de novo mutations (DNMs); by contrast, clinicians’ ability to counsel the parents about the risk of recurrence in a future child has lagged behind. Owing to the possibility that one of the parents could be mosaic in their germline, a recurrence risk of 1-2% is frequently quoted, but for any specific couple, this figure is usually incorrect. We present a systematic approach to providing individualized recurrence risk stratification, by combining deep-sequencing of multiple tissues in the mother-father-child trio with haplotyping to determine the parental origin of the DNM. In the first 58 couples analysed (total of 59 DNMs in 49 different genes), the risk for 35 (59%) DNMs was decreased below 0.1% but for 6 (10%) couples it was increased owing to parental mosaicism - that could be quantified in semen (recurrence risks of 5.6-12.1%) for the paternal cases. Deep-sequencing of the DNM efficiently identifies couples at greatest risk for recurrence and may qualify them for additional reproductive technologies. Haplotyping can further reassure many other couples that their recurrence risk is very low, but its implementation is more technically challenging and will require better understanding of how couples respond to information that reduces their risks.

Abstract Large animal models are of increasing importance in cardiovascular disease research as they demonstrate more similar cardiovascular features (in terms of anatomy, physiology and size) to humans than do rodent species. The maintenance of a healthy cardiovascular system requires expression of genes that contribute to essential biological activities and repression of those that are associated with functions likely to be detrimental to cardiovascular homeostasis. In this study we have used the transcriptome of the sheep, which has been utilised extensively to model human physiology and disease, to explore genes implicated in the process of vascular calcification. Vascular calcification is a major disruption to cardiovascular homeostasis where tissues of the cardiovascular system undergo ectopic calcification and consequent dysfunction. We investigate the gene expression profiles of genes involved in vascular calcification in a wide array of cardiovascular tissues and across multiple developmental stages, using RT-qPCR. The majority of transcriptomic studies on the mammalian cardiovascular system to date have focused on regional expression of specific genes. Here we also use RNA sequencing results from the sheep heart and cardiac valves to further explore the transcriptome of the cardiovascular system in this large animal. Our results demonstrate that there is a balance between genes that promote and those that suppress mineralisation during development and across cardiovascular tissues. We show extensive expression of genes encoding proteins involved in formation and maintenance of the extracellular matrix in cardiovascular tissues, and high expression of haematopoietic genes in the cardiac valves. Our analysis will support future research into the functions of implicated genes in the development of vascular calcification, and increase the utility of the sheep as a large animal model for understanding cardiovascular disease. This study provides a foundation to explore the transcriptome of the developing cardiovascular system and is a valuable resource for the fields of mammalian genomics and cardiovascular research.

While it is widely thought that de novo mutations (DNMs) occur randomly, we previously showed that some DNMs are enriched because they are positively selected in the testes of aging men. These "selfish" mutations cause disorders with a shared presentation of features, including exclusive paternal origin, significant increase of the father's age, and high apparent germline mutation rate. To date, all known selfish mutations cluster within the components of the RTK-RAS-MAPK signaling pathway, a critical modulator of testicular homeostasis. Here, we demonstrate the selfish nature of the SMAD4 DNMs causing Myhre syndrome (MYHRS). By analyzing 16 informative trios, we show that MYHRS-causing DNMs originated on the paternally derived allele in all cases. We document a statistically significant epidemiological paternal age effect of 6.3 years excess for fathers of MYHRS probands. We developed an ultra-sensitive assay to quantify spontaneous MYHRS-causing SMAD4 variants in sperm and show that pathogenic variants at codon 500 are found at elevated level in sperm of most men and exhibit a strong positive correlation with donor's age, indicative of a high apparent germline mutation rate. Finally, we performed in vitro assays to validate the peculiar functional behavior of the clonally selected DNMs and explored the basis of the pathophysiology of the different SMAD4 sperm-enriched variants. Taken together, these data provide compelling evidence that SMAD4, a gene operating outside the canonical RAS-MAPK signaling pathway, is associated with selfish spermatogonial selection and raises the possibility that other genes/pathways are under positive selection in the aging human testis.

ABSTRACT The laboratory rat is an important model for biomedical research. To generate a comprehensive rat transcriptomic atlas, we curated and down-loaded 7700 rat RNA-seq datasets from public repositories, down-sampled them to a common depth and quantified expression. Data from 590 rat tissues and cells, averaged from each Bioproject, can be visualised and queried at http://biogps.org/ratatlas . Gene correlation network (GCN) analysis revealed clusters of transcripts that were tissue or cell-type restricted and contained transcription factors implicated in lineage determination. Other clusters were enriched for transcripts associated with biological processes. Many of these clusters overlap with previous data from analysis of other species whilst some (e.g. expressed specifically in immune cells, retina/pineal gland, pituitary and germ cells) are unique to these data. GCN on large subsets of the data related specifically to liver, nervous system, kidney, musculoskeletal system and cardiovascular system enabled deconvolution of cell-type specific signatures. The approach is extensible and the dataset can be used as a point of reference from which to analyse the transcriptomes of cell types and tissues that have not yet been sampled. Sets of strictly co-expressed transcripts provide a resource for critical interpretation of single cell RNA-seq data.

Abstract Homozygous mutation of the Csf1r locus ( Csf1rko ) in mice, rats and humans leads to multiple postnatal developmental abnormalities. To enable analysis of the mechanisms underlying the phenotypic impacts of Csf1r mutation, we bred a rat Csf1rko allele to the inbred dark agouti (DA) genetic background and to a Csf1r -mApple reporter transgene. The Csf1rko led to almost complete loss of embryonic macrophages and ablation of most adult tissue macrophage populations. We extended previous analysis of the Csf1rko phenotype to early postnatal development to reveal impacts on musculoskeletal development and proliferation and morphogenesis in multiple organs. Expression profiling of 3-week old wild-type (WT) and Csf1rko livers identified 2760 differentially expressed genes associated with the loss of macrophages, severe hypoplasia, delayed hepatocyte maturation, disrupted lipid metabolism and the IGF1/IGF binding protein system. Older Csf1rko rats developed severe hepatic steatosis. Consistent with the developmental delay in the liver Csf1rko rats had greatly-reduced circulating IGF1. Transfer of WT bone marrow (BM) cells at weaning without conditioning repopulated resident macrophages in all organs, including microglia in the brain and reversed the mutant phenotypes enabling long term survival and fertility. WT BM transfer restored osteoclasts, eliminated osteopetrosis, restored bone marrow cellularity and architecture and reversed granulocytosis and B cell deficiency. Csf1rko rats had an elevated circulating CSF1 concentration which was rapidly reduced to WT levels following BMT. However, CD43 hi non-classical monocytes, absent in the Csf1rko , were not rescued and bone marrow progenitors remained unresponsive to CSF1. The results demonstrate that the Csf1rko phenotype is autonomous to BM-derived cells and indicate that BM contains a progenitor of tissue macrophages distinct from hematopoietic stem cells. The model provides a unique system in which to define the pathways of development of resident tissue macrophages and their local and systemic roles in growth and organ maturation.

Background: The domestic chicken (Gallus gallus) is widely used as a model in developmental biology and is also an important livestock species. We describe a novel approach to data integration to generate an mRNA expression atlas for the chicken spanning major tissue types and developmental stages, using a diverse range of publicly-archived RNA-seq datasets and new data derived from immune cells and tissues. Results: Randomly down-sampling RNA-seq datasets to a common depth and quantifying expression against a reference transcriptome using the mRNA quantitation tool Kallisto ensured that disparate datasets explored comparable transcriptomic space. The network analysis tool Miru was used to extract clusters of co-expressed genes from the resulting expression atlas, many of which were tissue or cell-type restricted, contained transcription factors that have previously been implicated in their regulation, or were otherwise associated with biological processes, such as the cell cycle. The atlas provides a resource for the functional annotation of genes that currently have only a locus ID. We cross-referenced the RNA-seq atlas to a publicly available embryonic Cap Analysis of Gene Expression (CAGE) dataset to infer the developmental time course of organ systems, and to identify a signature of the expansion of tissue macrophage populations during development. Conclusion: Expression profiles obtained from public RNA-seq datasets - despite being generated by different laboratories using different methodologies - can be made comparable to each other. This meta-analytic approach to RNA-seq can be extended with new datasets from novel tissues, and is applicable to any species.

Goats (Capra hircus) are an economically important livestock species providing meat and milk across the globe. They are of particular importance in tropical agri-systems contributing to sustainable agriculture, alleviation of poverty, social cohesion and utilisation of marginal grazing. There are excellent genetic and genomic resources available for goats, including a highly contiguous reference genome (ARS1). However, gene expression information is limited in comparison to other ruminants. To support functional annotation of the genome and comparative transcriptomics we created a mini-atlas of gene expression for the domestic goat. RNA-Seq analysis of 22 transcriptionally rich tissues and cell-types detected the majority (90%) of predicted protein-coding transcripts and assigned informative gene names to more than 1000 previously unannotated protein-coding genes in the current reference genome for goat (ARS1). Using network-based cluster analysis we grouped genes according to their expression patterns and assigned those groups of co-expressed genes to specific cell populations or pathways. We describe clusters of genes expressed in the gastro-intestinal tract and provide the expression profiles across tissues of a subset of genes associated with functional traits. Comparative analysis of the goat atlas with the larger sheep gene expression atlas dataset revealed transcriptional differences between the two species in macrophage-associated signatures. The goat transcriptomic resource complements the large gene expression dataset we have generated for sheep and contributes to the available genomic resources for interpretation of the relationship between genotype and phenotype in small ruminants.

Milk yield is the most important dairy sheep trait and constitutes the key genetic improvement goal via selective breeding. Mastitis is one of the most prevalent diseases, significantly impacting on animal welfare, milk yield and quality, while incurring substantial costs. Our objectives were to determine the feasibility of a concomitant genetic improvement programme for enhanced milk production and resistance to mastitis. Individual records for milk yield and four mastitis-related traits were collected monthly throughout lactation for 609 ewes of the Chios breed. All ewes were genotyped with a mastitis specific custom-made 960 single nucleotide polymorphism array. We performed genomic association studies, (co)variance component estimation and pathway enrichment analysis, and characterised gene expression levels and the extent of allelic expression imbalance. Presence of heritable variation for milk yield was confirmed. There was no significant genetic correlation between milk yield and mastitis. Environmental factors appeared to favour both milk production and udder health. Four Quantitative Trait Loci (QTLs) affecting milk yield were detected on chromosomes 2, 12, 16 and 19, in locations distinct from those previously identified to affect mastitis resistance. Pathways, networks and functional gene clusters for milk yield were identified. Seven genes (DNAJA1, DNAJC10, FGF10, GHR, HMGCS1, LYPLA1, OXCT1) located within the QTL regions were highly expressed in both the mammary gland and milk transcriptome, suggesting involvement in milk synthesis and production. Furthermore, the expression of four genes (DNAJC10, FGF10, OXCT1, EMB) was enriched in immune tissues implying a favourable pleiotropic effect or likely role in milk production during udder infection. In conclusion, the absence of genetic antagonism between milk yield and mastitis resistance suggests that simultaneous genetic improvement of both traits be achievable. The detection of milk yield QTLs with the mastitis array underpins the latter's utility as a breeding tool for the genetic enhancement of both traits.

Campylobacter is the leading cause of bacterial foodborne gastroenteritis in many countries. Source attribution studies unequivocally identify the handling or consumption of contaminated poultry meat as the primary risk factor. One potential strategy to control Campylobacter is to select poultry with increased resistance to colonisation. We conducted genomic and transcriptomic analyses of commercial pedigree broilers exposed to Campylobacter to examine persistent colonisation of the caecum as a quantitative trait. 3,000 broilers were genotyped using a 50K single nucleotide polymorphism (SNP) array and imputed to 600K SNPs. Genotypes were analysed for associations with the number of viable Campylobacter in the caeca. Heritability of the trait was modest but significantly greater than zero (h 2 =0.11 ± 0.03). Genome-wide association analyses confirmed quantitative trait loci (QTL) on chromosomes 14 and 16 previously identified using the progeny of crosses of inbred lines differing in resistance, and detected two additional genome-wide significant QTLs on chromosomes 19 and 26. RNA-Seq analysis of the transcriptome of caecal tonsils from birds at the low and high extremes of C. jejuni colonisation phenotype identified differentially transcribed genes, mainly located within the QTL on chromosome 16 and proximal to the major histocompatibility complex (MHC) locus. We also identified strong cis -QTLs located within the MHC suggesting the presence of cis -acting variation in both MHC class I, class II and BG genes. Multiple other cis- acting variants were identified in association with key immune genes (COPS3, CCL4, CR1L, C4BP, PLGR) in the other QTLs. Pathway and network analysis implicated cooperative functional pathways and networks in colonisation, including those related to antigen presentation, innate and adaptive immune responses, calcium, and renin-angiotensin signalling. While co-selection for enhanced resistance and other breeding goal traits is feasible, the frequency of resistance-associated alleles was high in the population studied and non-genetic factors significantly influence Campylobacter colonisation in poultry.### Competing Interest Statement

One of the most significant physiological challenges to neonatal and juvenile ruminants is the development and establishment of the rumen. Using a subset of RNA-Seq data from our high-resolution atlas of gene expression in sheep (Ovis aries) we have provided the first comprehensive characterisation of transcription of the entire the gastrointestinal (GI) tract during the transition from pre-ruminant to ruminant. The dataset comprises 168 tissue samples from sheep at four different time points (birth, one week, 8 weeks and adult). Using network cluster analysis we illustrate how the complexity of the GI tract is reflected in tissue- and developmental stage-specific differences in gene expression. The most significant transcriptional differences between neonatal and adult sheep were observed in the rumen complex. Differences in transcription between neonatal and adult sheep were particularly evident in macrophage specific signatures indicating they might be driving the observed developmental stage-specific differences. Comparative analysis of gene expression in three GI tract tissues from age-matched sheep and goats revealed species-specific differences in genes involved in immunity and metabolism. This study improves our understanding of the transcriptomic mechanisms involved in the transition from pre-ruminant to ruminant. It highlights key genes involved in immunity, microbe recognition, metabolism and cellular differentiation in the GI tract. The results form a basis for future studies linking gene expression with microbial colonisation of the developing GI tract and will contribute towards identifying genes that underlie immunity in early development, which could be utilised to improve ruminant efficiency and productivity.