Abstract Solid tumours have abnormally high intracellular [Na + ]. The activity of various Na + channels may underlie this Na + accumulation. Voltage-gated Na + channels (VGSCs) have been shown to be functionally active in cancer cell lines, where they promote invasion. However, the mechanisms involved, and clinical relevance, are incompletely understood. Here, we show that protein expression of the Na v 1.5 VGSC subtype strongly correlates with increased metastasis and shortened cancer-specific survival in breast cancer patients. In addition, VGSCs are functionally active in patient-derived breast tumour cells, cell lines, and cancer-associated fibroblasts. Knockdown of Na v 1.5 in a mouse model of breast cancer suppresses expression of invasion-regulating genes. Na v 1.5 activity increases ATP demand and glycolysis in breast cancer cells, likely by upregulating activity of the Na + /K + ATPase, thus promoting H + production and extracellular acidification. The pH of murine xenograft tumours is lower at the periphery than in the core, in regions of higher proliferation and lower apoptosis. In turn, acidic extracellular pH elevates persistent Na + influx through Na v 1.5 into breast cancer cells. Together, these findings show positive feedback between extracellular acidification and the movement of Na + into cancer cells which can facilitate invasion. These results highlight the clinical significance of Na v 1.5 activity as a potentiator of breast cancer metastasis and provide further evidence supporting the use of VGSC inhibitors in cancer treatment.

ABSTRACT Cancer cells feature a resting membrane potential ( V m ) that is depolarized compared to normal cells, and express active ionic conductances, which factor directly in their pathophysiological behavior. Despite similarities to ‘excitable’ tissues, relatively little is known about cancer cell V m dynamics. With high-throughput, cellular-resolution V m imaging, we characterized V m fluctuations of hundreds of human triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cells and compared to non-cancerous breast epithelial MCF-10A cells. By quantifying their Dynamic Electrical Signatures (DESs) through an unsupervised machine-learning protocol, we identified four classes ranging from “noisy” to “blinking/waving”. The V m of MDA-MB-231 cells exhibited spontaneous, transient hyperpolarizations that were inhibited by the voltage-gated sodium channel blocker tetrodotoxin. The V m of MCF-10A cells was comparatively static, but fluctuations increased following treatment with transforming growth factor-β1, a canonical inducer of the epithelial-to-mesenchymal transition. These data suggest that the ability to generate V m fluctuations is acquired during transformation and may participate in oncogenesis.

Abstract YAP and TAZ are transcriptional co-activators that are often constitutively active in triple negative breast cancer (TNBC) cells driving proliferation, invasion, and drug resistance. Through multiplexed quantitative genetic screens for YAP/TAZ localisation and cell shape, we found that the RhoGEF DOCK5 is essential for YAP/TAZ activation in metastatic cells and is required for the maintenance of polarity during migration. DOCK5 regulates cell shape and thus YAP/TAZ through different genetic interactions with CDC42, RAC, and RHOA GTPases. DOCK5 regulates focal adhesion (FA) morphogenesis in RAC-dependent fashions that promote RHOA mediated actomyosin engagement of FA. Using unbiased systems-level quantification of protein levels by mass spectrometry we show that DOCK5 maintains polarity by stabilising protein levels of the CDC42 effector GSK3β. We conclude DOCK5 acts as a coincidence detector to promote leading edge persistence in subcellular locations where there is both RAC and RHOA dependent FA morphogenesis and active CDC42 mediated cell polarisation.

The concentration of many transcription factors exhibit high cell-to-cell variability due to differences in synthesis, degradation, and cell size. Whether the functions of these factors are robust to fluctuations in...

The shape, size, and architecture of the nucleus determines the output of transcriptional programmes. As such, the ability of the nucleus to resist deformation and maintain its shape is essential for homeostasis. Conversely, changes in nuclear shape can alter transcription and cell state. The ability of cells to deform their nuclei is also essential for cells to invade confined spaces. But how cells set the extent of nuclear deformability in response to their environment is unclear. Here we show that the cell-cell adhesion protein JAM3 regulates nuclear shape. In epithelial cells, JAM3 is required for maintenance of nuclear shape by organizing microtubule polymers and promoting LMNA stabilization in the nuclear membrane. Depletion of JAM3 in normal epithelial cells leads to dysmorphic nuclei, which leads to differentiation into a mesenchymal-like state. Inhibiting the actions of kinesins in JAM3 depleted cells restores nuclear morphology and prevents differentiation into the mesenchymal-like state. Critically, JAM3 expression is predictive of disease progression. Thus JAM3 is a molecule which allows cells to control cell fates in response to the presence of neighbouring cells by tuning the extent of nuclear deformability.

Abstract Centriole and/or cilia defects are characteristic of cancer cells and have been linked to cancer cell invasion. However, the mechanistic basis of these effects is unknown. Spindle assembly abnormal protein 6 homolog (SAS-6) is essential for centriole biogenesis and cilia formation. In cycling cells, SAS-6 undergoes APC Cdh1 -mediated targeted degradation by the 26S proteasome at the end of mitosis. Little is known about the function of SAS-6 outside of centrosome biogenesis. To examine this, we expressed a non-degradable SAS-6 mutant (SAS-6ND). Expression of SAS-6ND led to an increase in ciliation and cilia-dependent cell invasion, and caused an upregulation of the YAP/TAZ pathway. YAP/TAZ or ciliogenesis inhibition prevented SAS-6-induced invasion. SAS-6ND caused increased actin alignment and stress fiber coherency, and nuclear flattening known to promote YAP nuclear import. Finally, data from The Cancer Genome Atlas showed that SAS-6 overexpression is associated with poor prognosis in various cancers. Our data provide evidence for a defined role of SAS-6 in cancer cell invasion and offers mechanistic insight into the role of YAP/TAZ in this cilia-sensitive process. Synopsis SAS-6 overexpressing cells show increased ciliation, actin cytoskeleton reorganization, cell flattening, YAP pathway activation and increased invasion

Abstract Almost all living cells maintain size uniformity through successive divisions. Proteins that sub- or super-scale with size act as rheostats which regulate cell progression. A comprehensive atlas of these proteins is lacking; particularly in cancer cells where both mitogen and growth signalling are dysregulated. Utilising a multi-omic strategy, that integrates quantitative single cell imaging, phosphoproteomic and transcriptomic datasets, we leverage the inherent size heterogeneity of melanoma cells to investigate how peptides, post-translational modifications, and mRNAs scale with cell size to regulate proliferation. We find melanoma cells have different mean sizes, but all retain uniformity. Across the proteome, we identify proteins and phosphorylation events that ‘sub’ and ‘super’ scale with cell size. In particular, G2/M, biosynthetic, and cytoskeletal regulators sub- and super-scale with size. In small cells growth and proliferation processes are tightly coupled by translation which promotes CCND1 accumulation and anabolic increases in mass. Counter intuitively, anabolic growth pathways and translational process are low in large cells, which throttles the expression of factors such as CCND1 and thereby coupling proliferation from anabolic growth. Strikingly, these cells exhibit increased growth and comparable proliferation rates. Mathematical modelling suggests that decoupling growth and proliferative signalling fosters proliferation under mitogenic inhibition. As factors which promote adhesion and actin reorganization super-scale with size or are enriched in large cells, we suggest that growth/proliferation in these cells may be decoupled by cell spreading and mechanics. This study provides one of the first demonstrations of size-scaling phenomena in cancer and how morphology determines the chemistry of the cell.

Abstract Solid tumours have abnormally high intracellular [Na + ]. The activity of various Na + transporting proteins including channels may underlie this Na + accumulation. Here, we show that voltage-gated Na + channels (VGSCs) are functionally active in a subset of breast cancer cell lines, cancer-associated fibroblasts, xenograft tumours and metastases. Downregulation of the Na v 1.5 VGSC in xenograft breast tumours suppresses expression of invasion-regulating genes, consistent with previous studies showing that Na v 1.5 promotes invasion in cancer cells. We also show that Na v 1.5 activity increases glycolysis, promoting extracellular acidification that would facilitate this invasion. In a reciprocal interaction, acidic extracellular pH elevates persistent Na + influx through Na v 1.5 in breast cancer cells. Using a mathematical model, we show that Na v 1.5 activity can sustain production of extracellular H + . We show that likely VGSC currents are detectable in patient-derived breast tumour cells and tissues. Furthermore, protein expression of Na v 1.5 strongly correlates with increased metastasis and shortened cancer-specific survival in breast cancer patients. Together, these findings show positive feedback between extracellular acidification and movement of Na + into cancer cells which can facilitate invasion. They also highlight the clinical significance of Na v 1.5 as a potentiator of breast cancer metastasis and provide further evidence supporting the use of VGSC inhibitors in cancer treatment.

The concentration of many transcription factors exhibit high cell-to-cell variability due to differences in synthesis, degradation, and cell size. How these factors are robust to fluctuations in concentration is poorly understood. Here we quantified the single cell levels of the YAP/TAZ transcriptional co-activators in parallel with cell morphology for over 400,000 single cells across 17 cell lines. We show the whole cell concentration of YAP/TAZ sub-scales with respect to size as cells grow during proliferation. However, the mean nuclear concentration of YAP/TAZ remains constant during the cell cycle. Theoretical modelling demonstrates that the extent to which whole cell YAP/TAZ dilutes in single cells during proliferative growth dictates the variability of YAP/TAZ levels across the population. Integrative analysis of imaging and proteomic data show the average nuclear YAP/TAZ concentration is predicted by differences in RAS/MAPK signalling, focal adhesion maturation, and nuclear transport processes. We developed a statistical framework capable of discriminating between perturbations that affect YAP/TAZ directly, or via changes in morphology. Deployment of these models on genetic screening data or small-molecule treatments reveal that inhibition of MEK, CDK4/6, LATS and RhoGTPases decouple nuclear YAP/TAZ from cell morphology by regulating nuclear translocation. Thus signalling activity couples size changes to YAP/TAZ translocation; leading to a stable pool of nuclear YAP/TAZ during proliferation. Significance Statement Many proteins dilute/concentrate with changes in cell size. It is unclear how robustness in cell signalling emerges across differently sized cells, with varying intracellular protein concentrations, over generations. Here, we have shown that despite whole cell dilution of the transcriptional co activators YAP/TAZ with increasing size, a steady-state nuclear concentration distribution is maintained across the population. Thus nuclear transport promotes robustness of signal response in the face of a dwindling cytoplasmic YAP/TAZ levels. An integrative approach revealed that focal adhesions, RAS/MAPK and nuclear import contributes to the the maintenance of YAP/TAZ nuclear levels. Cells appear to have evolved systems to ensure robustness against alterations to cell size during the cell cycle.

ABSTRACT The architecture of the endoplasmic reticulum (ER) is tightly controlled as a key determinant of its function. Its dynamics are linked to those of the cytoskeleton, but our understanding of how this coordination occurs and what its functional relevance is, is limited. We found the Unfolded Protein Response (UPR) transducer EIF2AK3/PERK is essential for acute stress-induced peripheral redistribution and remodeling of the ER, through eIF2a phosphorylation and translation initiation shutdown. PERK-mediated eIF2a phosphorylation can be bypassed by blocking ribosome activity; by depleting microtubule-anchoring ER proteins such as REEP4, p180/RRBP1 and Climp63/CKAP4; or by disrupting the microtubule cytoskeleton. Notably, specific disruption of non-centrosomal microtubules, but not centrosome depletion, relieved blockade of ER redistribution in PERK-deficient cells. Conversely, PERK deficiency stabilized non-centrosomal microtubules, promoting polarized protrusiveness in epithelial cells and neuroblasts. We propose that PERK coordinates ER architecture and homeostasis with cell morphogenesis by coupling ER remodeling and non-centrosomal MT dynamics.