Preclinical mouse models suggest that the gut microbiome modulates tumor response to checkpoint blockade immunotherapy; however, this has not been well-characterized in human cancer patients. Here we examined the oral and gut microbiome of melanoma patients undergoing anti-programmed cell death 1 protein (PD-1) immunotherapy (

The root-rhizosphere interface of Populus is the nexus of a variety of associations between bacteria, fungi, and the host plant and an ideal model for studying interactions between plants and microorganisms. However, such studies have generally been confined to greenhouse and plantation systems. Here we analyze microbial communities from the root endophytic and rhizospheric habitats of Populus deltoides in mature natural trees from both upland and bottomland sites in central Tennessee. Community profiling utilized 454 pyrosequencing with separate primers targeting the V4 region for bacterial 16S rRNA and the D1/D2 region for fungal 28S rRNA genes. Rhizosphere bacteria were dominated by Acidobacteria (31%) and Alphaproteobacteria (30%), whereas most endophytes were from the Gammaproteobacteria (54%) as well as Alphaproteobacteria (23%). A single Pseudomonas-like operational taxonomic unit (OTU) accounted for 34% of endophytic bacterial sequences. Endophytic bacterial richness was also highly variable and 10-fold lower than in rhizosphere samples originating from the same roots. Fungal rhizosphere and endophyte samples had approximately equal amounts of the Pezizomycotina (40%), while the Agaricomycotina were more abundant in the rhizosphere (34%) than endosphere (17%). Both fungal and bacterial rhizosphere samples were highly clustered compared to the more variable endophyte samples in a UniFrac principal coordinates analysis, regardless of upland or bottomland site origin. Hierarchical clustering of OTU relative abundance patterns also showed that the most abundant bacterial and fungal OTUs tended to be dominant in either the endophyte or rhizosphere samples but not both. Together, these findings demonstrate that root endophytic communities are distinct assemblages rather than opportunistic subsets of the rhizosphere.

Adoptive T cell therapy (ACT) produces durable responses in some cancer patients; however, most tumors are refractory to ACT and the molecular mechanisms underlying resistance are unclear. Using two independent approaches, we identified tumor glycolysis as a pathway associated with immune resistance in melanoma. Glycolysis-related genes were upregulated in melanoma and lung cancer patient samples poorly infiltrated by T cells. Overexpression of glycolysis-related molecules impaired T cell killing of tumor cells, whereas inhibition of glycolysis enhanced T cell-mediated antitumor immunity in vitro and in vivo. Moreover, glycolysis-related gene expression was higher in melanoma tissues from ACT-refractory patients, and tumor cells derived from these patients exhibited higher glycolytic activity. We identified reduced levels of IRF1 and CXCL10 immunostimulatory molecules in highly glycolytic melanoma cells. Our findings demonstrate that tumor glycolysis is associated with the efficacy of ACT and identify the glycolysis pathway as a candidate target for combinatorial therapeutic intervention.

The Carbohydrate-Active Enzyme (CAZy) database provides a rich set of manually annotated enzymes that degrade, modify, or create glycosidic bonds. Despite rich and invaluable information stored in the database, software tools utilizing this information for annotation of newly sequenced genomes by CAZy families are limited. We have employed two annotation approaches to fill the gap between manually curated high-quality protein sequences collected in the CAZy database and the growing number of other protein sequences produced by genome or metagenome sequencing projects. The first approach is based on a similarity search against the entire nonredundant sequences of the CAZy database. The second approach performs annotation using links or correspondences between the CAZy families and protein family domains. The links were discovered using the association rule learning algorithm applied to sequences from the CAZy database. The approaches complement each other and in combination achieved high specificity and sensitivity when cross-evaluated with the manually curated genomes of Clostridium thermocellum ATCC 27405 and Saccharophagus degradans 2-40. The capability of the proposed framework to predict the function of unknown protein domains and of hypothetical proteins in the genome of Neurospora crassa is demonstrated. The framework is implemented as a Web service, the CAZymes Analysis Toolkit, and is available at http://cricket.ornl.gov/cgi-bin/cat.cgi.

ABSTRACT Background Adenoid cystic carcinoma (ACC) is a rare, slow growing yet aggressive head and neck malignancy. Despite its clinical significance, our understanding of the cellular evolution and microenvironment in ACC remains limited. Methods We investigated the intratumoral microbiome of 50 ACC tumors and 33 adjacent normal tissues using 16S rRNA gene sequencing. This allowed us to characterize the bacterial communities within ACC and explore potential associations between the bacterial community structure, patient’s clinical characteristics, and tumor molecular features obtained through RNA sequencing. Results Bacterial composition in ACC displayed significant differences compared to adjacent normal salivary tissue and exhibited diverse levels of species richness. We identified two main microbial subtypes within ACC: oral-like and gut-like. Oral-like microbiomes, characterized by higher diversity and abundance of genera like Neisseria, Leptotrichia, Actinomyces, Streptococcus, Rothia , and Veillonella (commonly found in healthy oral cavities), were associated with the less aggressive ACC-II molecular subtype and improved patient outcomes. Notably, we identified the same oral genera in oral cancer and in head and neck squamous cell carcinomas. In both cancers, they were part of shared oral communities associated with more diverse microbiome, less aggressive tumor phenotype, and better survival. Conversely, gut-like microbiomes in ACC, featuring low diversity and colonization by gut mucus layer-degrading species like Bacteroides, Akkermansia, Blautia, Bifidobacterium , and Enterococcus , were associated with poorer outcomes. Elevated levels of Bacteroides thetaiotaomicron were independently associated with significantly worse survival, regardless of other clinical and molecular factors. Furthermore, this association positively correlated with tumor cell biosynthesis of glycan-based cell membrane components. Conclusions Our study uncovers specific intratumoral oral genera as potential pan-cancer biomarkers for favorable microbiomes in ACC and other head and neck cancers. These findings highlight the pivotal role of the intratumoral microbiome in influencing ACC prognosis and disease biology.

Objective: The aim of this study was to validate a whole exome sequencing approach to longitudinally characterize the tumor mutational profile of cervical cancer patients undergoing chemoradiation (CRT). Experimental Design: Cervical cancer tumor specimens from twenty-seven patients undergoing chemoradiation were collected before and throughout CRT and whole exome sequencing (WES) was performed to characterize individual mutations and alterations in unique genes. WES data were analyzed from cervical cancer patients in The Cancer Genome Atlas (TCGA) as a comparison group. Results: Over 93% of mutated genes detected at baseline were present in TCGA. Tumor purity from collected swabs correlated with MRI tumor volumes during the course of treatment (R2=0.969). CDK4/CDK6/cyclin D1-related gene mutations involved in the ERK1/2, p16INK4, and p53 pathway and G1/S checkpoint most commonly persisted at the end of CRT. Conclusion: This non-invasive swab technique to serially sample tumor during CRT will allow new discoveries of dynamic tumor mutational profile changes during chemoradiation for mucosal tumors. Mutations that survived or increased during the initial weeks of radiation treatment are potential drivers of radiation resistance including the CDL4/CDK6/cyclin D1-related pathway.

Abstract Purpose Next generation sequencing has progressed rapidly, characterizing microbial communities beyond culture-based or biochemical techniques. 16S ribosomal RNA gene sequencing (16S) produces reliable taxonomic classifications and relative abundances, while shotgun metagenome sequencing (WMS) allows higher taxonomic and functional resolution at greater cost. The purpose of this study was to determine if 16S and WMS provide congruent information for our patient population from paired fecal microbiome samples. Methods Patients with locally advanced cervical cancers were enrolled on a prospective, observational clinical trial with a rectal swab sample collected prior to chemoradiation. Bacterial DNA was extracted from each sample and divided in two parts for 16S or WMS sequencing. We used measures of diversity richness and evenness as comparators of 16S and WMS sequencing. Relative abundances of the most common taxa were also compared between both datasets. Both techniques were tested against baseline patient demographics to assess associations identified with either or both methods. Results Comparative indices were highly congruent between 16S and WMS. The most abundant genera for 16S and WMS data did not overlap. Overlap was observed at the Phylum level, as expected. However, relative abundances correlated poorly between the two methodologies (all p>0.05). Hierarchical clustering of both sequencing analyses identified overlapping enterotypes. Both approaches were in agreement with regard to demographic variables. Conclusion Diversity, evenness and richness are comparable when using 16S and WMS techniques, however relative abundances of individual genera are not. Clinical associations with diversity and evenness metrics were similarly identified with WMS or 16S. Importance The gut microbiome plays an important role in regulating human health and disease. 16S rRNA gene sequencing (16S) and the whole-metagenome shotgun DNA sequencing (WMS) are two approaches to describe the microbial community. 16S sequencing via any amplicon sequencing-based method offers advantages over WMS in terms of precision (specific gene targeting). Additionally, 16S has historically been less costly due to the simplicity of library preparation and it does not require the same level read coverage as WMS. In this study, we performed both sequencing methods on a single rectal swab sample obtained from each cervical cancer patient prior to treatment. We showed that these two methods provide comparable information for diversity, evenness, and richness at higher taxonomic resolution, but are discrepant at a lower resolution. These methodological findings provide valuable information for the design and interpretation of future investigations of the role of the gut microbiome in cancer. Tweet (optional: 256 words, please submit a Tweet that conveys the essential message of your manuscript.) 16S may be sufficient for most initial studies of the gut microbiome in cancer patients, but WMS may be required for analysis of lower level taxonomy. Research support This research was supported in part by the Radiological Society of North America Resident/Fellow Award (to L.E.C.), the National Institutes of Health (NIH) through MD Anderson’s Cancer Center Support Grant P30CA016672, the Emerson Collective and the National Institutes of Health T32 grant #5T32 CA101642-14 (T.T.S). This study was partially funded by The University of Texas MD Anderson Cancer Center HPV-related Cancers Moonshot (L.E.C and A.K.).

Background: A diverse and abundant gut microbiome can improve cancer patients treatment response; however, the effect of pelvic chemoradiotherapy (CRT) on gut diversity and composition is unclear. The purpose of this prospective study was to identify changes in the diversity and composition of the gut microbiome during and after pelvic CRT. Materials and Methods: Rectal swabs from 58 women with cervical, vaginal, or vulvar cancer from two institutions were prospectively analyzed before CRT (baseline), during CRT (weeks 1, 3, and 5), and at first follow-up (week 12) using 16Sv4 rRNA gene sequencing of the V4 hypervariable region of the bacterial 16S rRNA marker gene. Observed operational taxonomic units (OTUs; representative of richness) and Shannon, Simpson, Inverse Simpson, and Fisher diversity indices were used to characterize alpha (within-sample) diversity. Changes over time were assessed using a paired t-test, repeated measures ANOVA, and linear mixed modeling. Compositional changes in specific bacteria over time were evaluated using linear discriminant analysis effect size. Results: Gut microbiome richness and diversity levels continually decreased throughout CRT (mean Shannon diversity index, 2.52 vs. 2.91; all P <0.01), but were at or near baseline levels in 60% of patients by week 12. Patients with higher gut diversity at baseline had the steepest decline in gut microbiome diversity. Gut microbiome composition was significantly altered during CRT, with increases in Proteobacteria and decreases in Clostridiales, but adapted after CRT, with increases in Bacteroides species. Conclusion: After CRT, gut microbiome diversity tends to return to baseline levels, but its structure and composition remain significantly altered. These changes should be considered when designing studies to analyze the gut microbiome as a predictive or prognostic biomarker in patients who receive pelvic CRT for gynecologic cancers.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.