Abstract Metastatic brain tumors are associated with significant morbidity and mortality. Recent trials have demonstrated the potential efficacy of immunotherapy for the management of brain metastasis (BrM), albeit in only a subset of patients. Understanding the BrM microenvironment and identifying the factors that shape this complex milieu can facilitate optimizing treatment strategies for this disease. The microbiome has been recognized as a hallmark of cancer with a major role in shaping response to immunotherapy. However, the role of the microbiome in BrM is largely unknown. We have previously reported that bacterial signals can be detected in BrM tumors via metagenomic analyses and staining. Here we present the spatial correlation between the intra-tumoral bacterial signal and the transcriptional changes in the tumor microenvironment. Tissue digital spatial profiling (DSP) and single-cell DSP were conducted on BrM tissue microarrays using the NanoString GeoMx® and CosMx® platforms, respectively. These assays incorporated a custom panel of pan-bacterial 16S rRNA probes, enabling a comparison between tumor regions and cells that showed a positive signal for bacterial 16S rRNA versus those that did not. DSP of BrM tumors revealed anti-bacterial responses and enrichment of innate immune activity in areas with 16S signal, suggesting an active host response to intra-tumoral 16S signals. Furthermore, single-cell DSP demonstrated a heterogenous distribution of cell types harboring the 16S signal in the tumor microenvironment. In tumor cells, intracellular 16S signal was associated with an upregulation of transcripts related to neuroinflammation, chemokine, and interleukin signaling. Furthermore, immune transcriptional changes were identified in the immediate neighborhood of 16S-positive cells. Overall, this study introduces bacterial signals as a novel element within metastatic brain tumors and demonstrates their association with anti-bacterial responses and immune activity. These findings set the foundation for future mechanistic and translational studies to evaluate microbiome modulation strategies in enhancing care for brain metastasis.

ABSTRACT Background Adenoid cystic carcinoma (ACC) is a rare, slow growing yet aggressive head and neck malignancy. Despite its clinical significance, our understanding of the cellular evolution and microenvironment in ACC remains limited. Methods We investigated the intratumoral microbiome of 50 ACC tumors and 33 adjacent normal tissues using 16S rRNA gene sequencing. This allowed us to characterize the bacterial communities within ACC and explore potential associations between the bacterial community structure, patient’s clinical characteristics, and tumor molecular features obtained through RNA sequencing. Results Bacterial composition in ACC displayed significant differences compared to adjacent normal salivary tissue and exhibited diverse levels of species richness. We identified two main microbial subtypes within ACC: oral-like and gut-like. Oral-like microbiomes, characterized by higher diversity and abundance of genera like Neisseria, Leptotrichia, Actinomyces, Streptococcus, Rothia , and Veillonella (commonly found in healthy oral cavities), were associated with the less aggressive ACC-II molecular subtype and improved patient outcomes. Notably, we identified the same oral genera in oral cancer and in head and neck squamous cell carcinomas. In both cancers, they were part of shared oral communities associated with more diverse microbiome, less aggressive tumor phenotype, and better survival. Conversely, gut-like microbiomes in ACC, featuring low diversity and colonization by gut mucus layer-degrading species like Bacteroides, Akkermansia, Blautia, Bifidobacterium , and Enterococcus , were associated with poorer outcomes. Elevated levels of Bacteroides thetaiotaomicron were independently associated with significantly worse survival, regardless of other clinical and molecular factors. Furthermore, this association positively correlated with tumor cell biosynthesis of glycan-based cell membrane components. Conclusions Our study uncovers specific intratumoral oral genera as potential pan-cancer biomarkers for favorable microbiomes in ACC and other head and neck cancers. These findings highlight the pivotal role of the intratumoral microbiome in influencing ACC prognosis and disease biology.