ABSTRACT A particular challenge hampering therapeutic advancements for high-risk sarcoma patients is the broad spectrum of molecularly distinct sarcoma entities and the corresponding lack of suitable model systems to recapitulate and study these diseases. To overcome this predicament, we developed a novel genetically-controlled, yet versatile mouse modeling platform allowing delivery of different genetic lesions by electroporation (EPO) of the thigh muscle wildtype mice. This optimized sarcoma EPO-GEMM (EPO-based genetically engineered mouse model) platform allowed the generation of ten biologically distinct sarcoma entities, including Synovial Sarcoma (SS), fusion-positive and fusion-negative Rhabdomyosarcoma (RMS), Alveolar Soft Part Sarcoma (ASPS), Undifferentiated Pleomorphic Sarcoma (UPS) and Infantile Fibrosarcoma (IFS). Comprehensive molecular profiling and cross-species analyses confirmed faithful recapitulation of the human disease, including the expression of relevant immunotherapy targets. Syngeneic allografting enabled reliable preservation and scalability of Sarcoma-EPO-GEMMs for treatment trials, such as B7-H3-directed CAR-T cell therapy in an immunocompetent background.

ABSTRACT Chromosome 8 (chr8) gains are common in cancer. However, their potential contribution to tumor heterogeneity is largely unexplored. Ewing sarcoma (EwS) is characterized by pathognomonic FET::ETS fusions, but show a general paucity of other recurrent somatic mutations that could explain the observed clinical diversity. In EwS, chr8 gains are the second most common genetic alteration rendering EwS an ideal model to investigate the relevance of chr8 gains in an otherwise silent genomic context. Here, we report that chr8 gain-driven gene expression patterns correlate with poor overall survival of EwS patients. This effect is predominantly mediated by increased expression of the translation initiation factor binding protein 4E-BP1 encoded by EIF4EBP1 on chr8. High EIF4EBP1 expression showed the strongest association with poor overall patient survival among all chr8-encoded genes and correlated with chr8 gains in EwS tumors. Similar findings were made in numerous entities of The Cancer Genome Atlas (TCGA). In the EwS model, silencing of 4E-BP1 reduced cell proliferation, clonogenicity, spheroidal growth in vitro , and tumorigenesis in vivo . Integrated multi- omics profiling uncovered that 4E-BP1 orchestrates a multifunctional proteomic network including hubs affecting RNA processing, translational regulation, and chromatin modification. Drug screens and functional assays revealed that high 4E-BP1 expression sensitizes for pharmacological CDK4/6 inhibition in preclinical models. Collectively, we establish chr8 gains and high 4E-BP1 expression as prognostic biomarkers in EwS and demonstrate that their association with poor patient outcome is primarily mediated by 4E-BP1 orchestrating a multifunctional proteomic network sensitizing EwS for CDK4/6 inhibitors. Our data suggest that testing for chr8 gain may improve risk-stratification and therapeutic management in EwS and other cancers.

Abstract Background Certain paediatric nervous system malignancies have dismal prognoses. Retinoic acid (RA) is used in neuroblastoma treatment, and preclinical data indicate potential benefit in selected paediatric brain tumour entities. However, limited single-agent efficacy necessitates combination treatment approaches. Methods We performed drug sensitivity profiling of 76 clinically relevant drugs in combination with RA in 16 models (including patient-derived tumouroids) of the most common paediatric nervous system tumours. Drug responses were assessed by viability assays, high-content imaging, and apoptosis assays and RA relevant pathways by RNAseq from treated models and patient samples obtained through the precision oncology programme INFORM ( n = 2288). Immunoprecipitation detected BCL-2 family interactions, and zebrafish embryo xenografts were used for in vivo efficacy testing. Results Group 3 medulloblastoma (MB G3 ) and neuroblastoma models were highly sensitive to RA treatment. RA induced differentiation and regulated apoptotic genes. RNAseq analysis revealed high expression of BCL2L1 in MB G3 and BCL2 in neuroblastomas. Co-treatments with RA and BCL-2/X L inhibitor navitoclax synergistically decreased viability at clinically achievable concentrations. The combination of RA with navitoclax disrupted the binding of BIM to BCL-X L in MB G3 and to BCL-2 in neuroblastoma, inducing apoptosis in vitro and in vivo. Conclusions RA treatment primes MB G3 and NB cells for apoptosis, triggered by navitoclax cotreatment.

Glioblastoma multiforme (GBM) are devastating neoplasms with high invasive capacity. GBM has been difficult to study in vitro. Therapeutic progress is also limited by cellular heterogeneity within and between tumors. To address these challenges, we present an experimental model using human cerebral organoids as a scaffold for patient-derived glioblastoma cell invasion. By tissue clearing and confocal microscopy, we show that tumor cells within organoids extend a network of long microtubes, recapitulating the in vivo behavior of GBM. Single-cell RNA-seq of GBM cells before and after co-culture with organoid cells reveals transcriptional changes implicated in the invasion process that are coherent across patient samples, indicating that GBM cells reactively upregulate genes required for their dispersion. Functional therapeutic targets are identified by an in silico receptor-ligand pairing screen detecting potential interactions between GBM and organoid cells. Taken together, our model has proven useful for studying GBM invasion and transcriptional heterogeneity in vitro, with applications for both pharmacological screens and patient-specific treatment selection at a time scale amenable to clinical practice.

Glioblastomas are the most lethal tumors affecting the central nervous system in adults. Simple and inexpensive syngeneic in vivo models that closely mirror human glioblastoma, including interactions between tumor and immune cells, are urgently needed for deciphering glioma biology and developing more effective treatments. Here, we generated glioblastoma cell lines by repeated in-vivo passaging of cells isolated from a neural stem cell-specific Pten/p53 double-knockout genetic mouse brain tumor model. Transcriptome and genome analyses of the cell lines revealed molecular heterogeneity comparable to that observed in human glioblastoma. Upon orthotopic transplantation into syngeneic hosts they formed high-grade gliomas that faithfully recapitulated the histopathological features, invasiveness and myeloid cell infiltration characteristic of human glioblastoma. These features make our cell lines unique and useful tools to study multiple aspects of glioblastoma pathomechanism and test novel treatments, especially immunotherapies in syngeneic preclinical models.

Ewing sarcoma (EwS) is a highly aggressive bone and soft-tissue associated cancer for which there are no effective targeted therapeutics available. Genetically, EwS is driven by aberrantly active EWSR1::ETS fusion transcription factors, most commonly EWSR1::FLI1. Despite their unique expression in EwS, all attempts to effectively target these fusion oncoproteins clinically were not yet successful, wherefore alternative targets are required. Here, we functionally characterize the evolutionarily conserved oxidative stress regulator glutaredoxin 3 (GLRX3) as a EwS-specific and EWSR1::FLI1-dependent vulnerability. Through integration of transcriptome-profiling, conditional drug screens in 3D cultures, and functional experiments, we discover that GLRX3 promotes EwS growth in vitro and in vivo, and that it has a key role in mitigation of oxidative stress and maintenance of iron homeostasis. These GLRX3 functions can be exploited in both GLRX3-high and -low expressing EwS cells by targeted therapeutics including CDK4/6 inhibitors and inducers of apoptotic and ferroptotic cell death. Collectively, our results exemplify how the interplay of an evolutionarily conserved oxidative stress regulator with a dominant oncogene can promote malignancy but provide opportunities for predictive diagnostics and personalized therapy.