Despite their widespread impact on human health there are no approved drugs for combating alphavirus infections. The heterocyclic β-aminomethyl vinyl sulfone RA-0002034 (

Abstract Protein kinases direct polarized growth by regulating the cytoskeleton in time and space, and could play similar roles in cell division. We found that the Cdc42-activated polarity kinase Pak1 colocalizes with the assembling contractile actomyosin ring (CAR) and remains at the division site during septation. Mutations in pak1 led to defects in CAR assembly and genetic interactions with cytokinesis mutants. Through a phosphoproteomic screen, we identified novel Pak1 substrates that function in polarized growth and cytokinesis. For cytokinesis, we found that Pak1 regulates the localization of its substrates Mid1 and Cdc15 to the CAR. Mechanistically, Pak1 phosphorylates the Mid1 N-terminus to promote its association with cortical nodes that act as CAR precursors. Defects in Pak1-Mid1 signaling lead to misplaced and defective division planes, but these phenotypes can be rescued by synthetic tethering of Mid1 to cortical nodes. Our work defines a new signaling mechanism driven by a cell polarity kinase that promotes CAR assembly in the correct time and place. Summary Magliozzi et al. show that fission yeast cell polarity kinase Pak1 regulates cytokinesis. Through a phosphoproteomic screen and subsequent mutant analysis, their work uncovers direct targets and mechanisms for Pak1 activity during cell division.

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are pivotal in combating cancer, yet their efficacy is often hindered by the immunosuppressive tumor microenvironment, resulting in exhaustion. This study investigates the role of interleukin (IL)-3 in orchestrating anti-tumor immunity through CTL modulation. Intratumoral CTLs undergo a progressive decline in IL-3 production, which is correlated with impaired cytotoxic function. Augmenting IL-3, through intraperitoneal administration, IL-3-expressing melanoma cells, or IL-3-engineered CD8+ T cells, confers protection against tumor progression, concomitant with increased CTL activity. CTLs are critical in this therapeutic efficacy as IL-3 demonstrates no impact on tumor growth in RAG1 knockout mice or following CD8+ T cell-depletion. Rather than acting directly, CTL-derived IL-3 exerts its influence on basophils, synergistically amplifying anti-tumor immunity within CTLs. Introducing IL-3-activated basophils retards tumor progression, whereas basophil depletion diminishes the effectiveness of IL-3 supplementation. Furthermore, IL-3 prompts basophils to produce IL-4, which subsequently elevates IFN-γ production and viability of CTLs. Notably, the importance of basophil-derived IL-4 is evident from the absent benefits in IL-3-supplementated, IL-4 knockout tumor-bearing mice. Overall, this research unveils IL-3-mediated CTL-basophil crosstalk in regulating anti-tumor immunity and offers the prospect of harnessing IL-3 sustenance as a promising approach for optimizing and enhancing cancer immunotherapy.

Glycolytic inhibition via 2-deoxy-D-glucose (2DG) has potential therapeutic benefits for a range of diseases, including cancer, epilepsy, systemic lupus erythematosus (SLE), and rheumatoid arthritis (RA), and COVID-19, but the systemic effects of 2DG on gene function across different tissues are unclear.This study analyzed the transcriptional profiles of nine tissues from C57BL/6J mice treated with 2DG to understand how it modulates pathways systemically. Principal component analysis (PCA), weighted gene co-network analysis (WGCNA), analysis of variance, and pathway analysis were all performed to identify modules altered by 2DG treatment.PCA revealed that samples clustered predominantly by tissue, suggesting that 2DG affects each tissue uniquely. Unsupervised clustering and WGCNA revealed six distinct tissue-specific modules significantly affected by 2DG, each with unique key pathways and genes. 2DG predominantly affected mitochondrial metabolism in the heart, while in the small intestine, it affected immunological pathways.These findings suggest that 2DG has a systemic impact that varies across organs, potentially affecting multiple pathways and functions. The study provides insights into the potential therapeutic benefits of 2DG across different diseases and highlights the importance of understanding its systemic effects for future research and clinical applications.

Chikungunya virus (CHIKV) is a mosquito-borne alphavirus that has been responsible for numerous large-scale outbreaks in the last twenty years. Currently, there are no FDA-approved therapeutics for any alphavirus infection. CHIKV non-structural protein 2 (nsP2), which contains a cysteine protease domain, is essential for viral replication, making it an attractive target for a drug discovery campaign. Here, we optimized a CHIKV nsP2 protease (nsP2pro) biochemical assay for the screening of a 6,120-compound cysteine-directed covalent fragment library. Using a 50% inhibition threshold, we identified 153 hits (2.5% hit rate). In dose-response follow up, RA-0002034, a covalent fragment that contains a vinyl sulfone warhead, inhibited CHIKV nsP2pro with an IC 50 of 58 ± 17 nM, and further analysis with time-dependent inhibition studies yielded a k inact /K I of 6.4 × 10 3 M -1 s -1 . LC-MS/MS analysis determined that RA-0002034 covalently modified the catalytic cysteine in a site-specific manner. Additionally, RA-0002034 showed no significant off-target reactivity against a panel of cysteine proteases. In addition to the potent biochemical inhibition of CHIKV nsP2pro activity and exceptional selectivity, RA-0002034 was tested in cellular models of alphavirus infection and effectively inhibited viral replication of both CHIKV and related alphaviruses. This study highlights the discovery and characterization of the chemical probe RA-0002034 as a promising hit compound from covalent fragment-based screening for future development toward a CHIKV or pan-alphavirus therapeutic.Chikungunya virus is one of the most prominent and widespread alphaviruses and has caused explosive outbreaks of arthritic disease. Currently, there are no FDA-approved drugs to treat disease caused by chikungunya virus or any other alphavirus-caused infection. Here, we report the discovery of a covalent small molecule inhibitor of chikungunya virus nsP2 protease activity and viral replication of four diverse alphaviruses. This finding highlights the utility of covalent fragment screening for inhibitor discovery and represents a starting point towards the development of alphavirus therapeutics targeting nsP2 protease.

Despite their widespread impact on human health, there are no approved drugs for combating alphavirus infections. The heterocyclic β-aminomethyl vinyl sulfone RA-0002034 (

Abstract Heightened glycolysis is inherent to immune/inflammatory disorders, but little is known of its role in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (lupus). Here, we profile key autoimmune populations in acute and chronic lupus-prone models and their response to glycolytic inhibition. We demonstrate that glycolysis is specifically required for autoreactive germinal center B cells (GCB), but not for T follicular helper cells (Tfh) to survive. This augmented reliance on glucose oxidation to maintain ATP production in pathogenic GCB renders them highly susceptible to oxidative stress-induced apoptosis triggered by glycolysis blockade via 2-deoxyglucose (2DG). We show that 2DG can preferentially reduce GCB in lupus-prone mice, while sparing other autoreactive populations, including Tfh, but still significantly improving lifespan and kidney function. Furthermore, the subset of GCB expressing B-cell maturation antigen (BCMA) exhibits an exaggerated dependence on glycolysis to sustain their growth. Depletion of these cells with a proliferation-inducing ligand-based CAR T-cells leads to greatly prolonged lifespan of mice with severe autoimmune activation. These results reveal that glycolysis dependent GCB, especially those expressing BCMA, are key lupus mediators and highlight that they can be selectively targeted to improve disease outcomes for lupus patients.