Abstract Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a second messenger that mediates diverse intracellular signals. Studies of cAMP transport in cells have produced wildly different results, from reports of nearly free diffusion to reports that cAMP remains localized in nanometer-scale domains. We developed an all-optical toolkit, termed cAMP-SITES, to locally perturb and map cAMP transport. In MDCK cells and in cultured neurons, cAMP had a diffusion coefficient of ∼120 µm 2 /s, similar to the diffusion coefficients of other small molecules in cytoplasm. In neuronal dendrites, a balance between diffusion and degradation led to cAMP domains with a length scale of ∼30 µm. Geometrical confinement by membranes led to subcellular variations in cAMP concentration, but we found no evidence of nanoscale domains or of distinct membrane-local and cytoplasmic pools. We introduce theoretical relations between cell geometry and small-molecule reaction-diffusion dynamics and transport to explain our observations.

Abstract Dynamic changes in the membrane potential underlie neuronal activities. Fluorescent voltage indicators allow optical recording of electrical signaling across a neuronal population with cellular precision and at millisecond-level temporal resolution. Here we report the design and characterization of a chemigenetic hybrid voltage indicator, Solaris, in which a circularly permuted HaloTag is inserted into the first extracellular loop of Acetabularia rhodopsin. Solaris is compatible with fluorogenic HaloTag ligands JF 525 , JF 549 , JF 552 , JF 585 , and JF 635 . The most sensitive conjugate, Solaris 585 , has more than 2-fold higher voltage sensitivity than the spectrally similar Voltron2 585 (ΔF/F 0 = -28.1 ± 1.3% versus -12.3 ± 0.7% per action potential in cultured neurons). Solaris 585 supports the measurement of optogenetically evoked spike activity or dual-color imaging in conjunction with green-emitting calcium or glutamate indicators. Solaris indicators are also applicable to fluorescence lifetime imaging, which probes the absolute membrane potential. This new hybrid voltage indicator is a valuable tool for imaging neuronal electrophysiological activities in cultured cells with substantially improved dynamic range compared to previous hybrid indicators.

Many channelrhodopsins are permeable to protons. We found that in neurons, activation of a high-current channelrhodopsin, CheRiff, led to significant acidification, with faster acidification in the dendrites than in the soma. Experiments with patterned optogenetic stimulation in monolayers of HEK cells established that the acidification was due to proton transport through the opsin, rather than through other voltage-dependent channels. We identified and characterized two opsins which showed large photocurrents, but small proton permeability, PsCatCh2.0 and ChR2-3M. PsCatCh2.0 showed excellent response kinetics and was also spectrally compatible with simultaneous voltage imaging with QuasAr6a. Stimulation-evoked acidification is a possible source of disruptions to cell health in scientific and prospective therapeutic applications of optogenetics. Channelrhodopsins with low proton permeability are a promising strategy for avoiding these problems.

Abstract Due to the nonlinear current-voltage relations of ion channels, an interface between two tissues can have very different bioelectrical properties compared to either tissue on its own. Here we show experimentally that gap junction-coupled interfaces between non-excitable tissues can be electrically excitable. This topologically protected excitability occurs over a far larger range of ion channel expression levels than does excitability in the bulk. Topological excitations at tissue interfaces can cause local elevations in calcium concentration, possibly providing a bioelectrical mechanism for interface sensing. As in condensed matter physics, topological excitations in electrophysiology constitute a distinct class of phenomena which may show exotic and novel properties.