1 Summary Gene regulation involves synergistic interactions between transcription factors (TFs). Classical thermodynamic models offer a biophysical understanding of synergy based on binding cooperativity and regulated recruitment of RNA polymerase. However, transcription requires polymerase to transition through multiple states. Accordingly, recent work has suggested that ”kinetic synergy” can arise through TFs differentially regulating distinct steps of the transcription cycle. Disentangling both sources of synergy has been challenging. Here, we combine theory and experiment to analyze TFs binding to a single shared site, thereby removing simultaneous specific DNA binding. Using the graph-based linear framework, we integrate TF binding with regulation of the transcription cycle, and reveal a complex kinetic synergy landscape dependent on TF concentration, DNA binding and transcriptional activity. We exploit synthetic zinc-finger TF fusions to experimentally interrogate these predictions. Our results confirm that transcription cycle regulation must be integrated with recruitment for a quantitative understanding of transcriptional control.

Abstract For decades, studies have noted that transcription factors (TFs) can behave as either activators or repressors of different target genes. More recently, evidence suggests TFs can act on transcription simultaneously in positive and negative ways. Here we use biophysical models of gene regulation to define, conceptualize and explore these two aspects of TF action: “duality”, where TFs can be overall both activators and repressors at the level of the transcriptional response, and “coherent and incoherent” modes of regulation, where TFs act mechanistically on a given target gene either as an activator or a repressor (coherent) or as both (incoherent). For incoherent TFs, the overall response depends on three kinds of features: the TF’s mechanistic effects, the dynamics and effects of additional regulatory molecules or the transcriptional machinery, and the occupancy of the TF on DNA. Therefore, activation or repression can be tuned by just the TF-DNA binding affinity, or the number of TF binding sites, given an otherwise fixed molecular context. Moreover, incoherent TFs can cause non-monotonic transcriptional responses, increasing over a certain concentration range and decreasing outside the range, and we clarify the relationship between non-monotonicity and common assumptions of gene regulation models. Using the mammalian SP1 as a case study and well controlled, synthetically designed target sequences, we find experimental evidence for incoherent action and activation, repression or non-monotonicity tuned by affinity. Our work highlights the importance of moving from a TF-centric view to a systems view when reasoning about transcriptional control.

Discontinuous transcription has been described for different mammalian cell lines and numerous promoters. However, our knowledge of how the activity of individual promoters is adjusted by dynamic signaling inputs from transcription factor is limited. To address this question, we characterized the activity of selected target genes that are regulated by pulsatile accumulation of the tumor suppressor p53 in response to ionizing radiation. We performed time resolved measurements of gene expression at the single cell level by smFISH and used the resulting data to inform a mathematical model of promoter activity. We found that p53 target promoters are regulated by frequency modulation of stochastic bursting and can be grouped along three archetypes of gene expression. The occurrence of these archetypes cannot solely be explained by nuclear p53 abundance or promoter binding of total p53. Instead, we provide evidence that the time-varying acetylation state of p53's C-terminal lysine residues is critical for gene-specific regulation of stochastic bursting.

Abstract The giant striated muscle protein titin integrates into the developing sarcomere to form a stable myofilament system that is extended as myocytes fuse. The logistics underlying myofilament assembly and disassembly have started to emerge with the possibility to follow labeled sarcomere components. Here, we generated the mCherry knock-in at titin’s Z-disk to study skeletal muscle development and remodeling. We find titin’s integration into the sarcomere tightly regulated and its unexpected mobility facilitating a homogenous distribution of titin after cell fusion – an integral part of syncytium formation and maturation of skeletal muscle. In adult mCherry-titin mice, treatment of muscle injury by implantation of titin-eGFP myoblasts reveals how myocytes integrate, fuse and contribute to the continuous myofilament system across cell boundaries. Unlike in immature primary cells, titin proteins are retained at the proximal nucleus and do not diffuse across the whole syncytium with implications for future cell-based therapies of skeletal muscle disease.

Cellular signaling systems precisely transmit information in the presence of molecular noise while retaining flexibility to accommodate the needs of individual cells. To understand design principles underlying such versatile signaling, we analyzed the response of the tumor suppressor p53 to varying levels of DNA damage in hundreds of individual cells and observed a switch between distinct signaling modes characterized by isolated pulses and sustained oscillations of p53 accumulation. Guided by dynamic systems theory we show that this requires an excitable network structure comprising positive feedback and provide experimental evidence for its molecular identity. The resulting dataN driven model reproduced all features of measured signaling responses and explained their heterogeneity in individual cells. We predicted and validated that heterogeneity in the levels of the feedback regulator Wip1 sets cellNspecific thresholds for p53 activation, providing means to modulate its response through interacting signaling pathways. Our results demonstrate how excitable signaling networks provide high specificity, sensitivity and robustness while retaining unique possibilities to adjust their function to the physiology of individual cells.