ABSTRACT Despite its small size, the water fern Azolla is a giant among plant symbioses. Within each of its leaflets, a specialized leaf cavity is home to a population of nitrogen-fixing cyanobacteria (cyanobionts). While examples of nitrogen fixing cyanobionts are found across the land plant tree of life, Azolla is unique in that its symbiosis is perpetual: the cyanobionts are inherited during sexual and vegetative propagation of the fern. What underpins the communication between the two partners? In angiosperms, the phytohormone salicylic acid (SA) is a well-known regulator of plant–microbe interactions. Using HPLC-MS/MS, we pinpoint the presence of SA in the fern; using comparative genomics and phylogenetics, we mined homologs of SA biosynthesis genes across Chloroplastida (Viridiplantae). While canonical isochorismate synthase (ICS) sequences are largely limited to angiosperms, homologs for the entire Phenylalanine ammonia-lyase (PAL)-dependent pathway likely existed in the last common ancestor of land plants. Indeed, A. filiculoides secondarily lost its ICS, but has the genetic competence to derive SA from benzoic acid. Global gene expression data from cyanobiont-containing and -free A. filiculoides unveil a putative feedback loop: SA appears to induce cyanobacterial proliferation, which in turn down-regulates genes in SA biosynthesis and its responses.

Abstract The trade-off between growth and defense is a critical aspect of plant immunity. Therefore, plant immune response needs to be tightly regulated. The hormone regulating plant defense against biotrophic pathogens is salicylic acid (SA). Recently, N -hydroxy-pipecolic acid (NHP) was identified as second regulator for plant innate immunity and systemic acquired resistance. Although the biosynthetic pathway leading to NHP formation has already been identified, the route how NHP is further metabolized was unclear. Here, we present UGT76B1 as a UDP-dependent glycosyltransferase that modifies NHP by catalyzing the formation of 1- O -glucosyl-pipecolic acid (NHP- O Glc). Analysis of T-DNA and CRISPR knock-out mutant lines of UGT76B1 by targeted and non-targeted UHPLC-HRMS underlined NHP and SA as endogenous substrates of this enzyme in response to Pseudomonas infection and UV treatment. UGT76B1 shows similar K M for NHP and SA. ugt76b1 mutant plants have a dwarf phenotype and a constitutive defense response which can be suppressed by loss of function of the NHP biosynthetic enzyme FMO1. This suggests that elevated accumulation of NHP contributes to the enhanced disease resistance in ugt76b1 . Externally applied NHP can move to distal tissue in ugt76b1 mutant plants. Although glycosylation is not required for the long distance movement of NHP during systemic acquired resistance, it is crucial to balance growth and defense.

Summary Xylem sap is the major transport route for nutrients from roots to shoots. Here, we investigated how variations in nitrogen (N) nutrition affected the metabolome and proteome of xylem sap, growth of the xylem endophyte Brennaria salicis and report transcriptional re-wiring of leaf defenses in poplar ( Populus x canescens ). We supplied poplars with high, intermediate or low concentrations of ammonium or nitrate. We identified 288 unique proteins in xylem sap. About 85% of the xylem sap proteins were shared among ammonium- and nitrate-supplied plants. The number of proteins increased with increasing N supply but the major functional categories (catabolic processes, cell wall-related enzymes, defense) were unaffected. Ammonium nutrition caused higher abundances of amino acids and carbohydrates, while nitrate caused higher malate levels in xylem sap. Pipecolic acid and N -hydroxy-pipecolic acid increased whereas salicylic acid and jasmonoyl-isoleucine decreased with increasing N nutrition. Untargeted metabolome analyses revealed 2179 features in xylem sap, of which 863 were differentially affected by N treatments. We identified 122 metabolites, mainly from specialized metabolism of the groups of salicinoids, phenylpropanoids, phenolics, flavonoids, and benzoates. Their abundances increased with decreasing N. Endophyte growth was stimulated in xylem sap of high N- and suppressed in that of low N-fed plants. The drastic changes in xylem sap composition caused massive changes in the transcriptional landscape of leaves and recruited defense pathways against leaf feeding insects and biotrophic fungi, mainly under low nitrate. Our study uncovers unexpected complexity and variability of xylem composition with consequences for plant defenses. Significance statement This study reports the largest, currently available plant xylem sap proteome and metabolome databases and highlights novel discoveries of specialized metabolites and phytohormones in the xylem sap. This is the first multi-omics study linking differences in nitrogen supply with changes xylem sap composition, endophyte growth and transcriptional defenses in leaves.

ABSTRACT The earliest land plants faced a significant challenge in adapting to environmental stressors. Stress on land is unique in its dynamics, entailing swift and drastic changes in light and temperature. While we know that land plants share with their closest streptophyte algal relatives key components of the genetic makeup for dynamic stress responses, their concerted action is little understood. Here, we combined time-course stress profiling using photophysiology, transcriptomics on 2.7 Tbp of data, and metabolite profiling analyses on more than 270 distinct samples, to study stress kinetics across three 600-million-year-divergent streptophytes. Through co-expression analysis and Granger causal inference we predict a gene regulatory network that retraces a web of ancient signal convergence at ethylene signaling components, osmosensors, and chains of major kinases. These kinase hubs already integrated diverse environmental inputs since before the dawn of plants on land.

Summary In spite of its medical importance, the genetic mechanisms of bacterial persistence, particularly spontaneous (type II) persistence, remain largely unknown. We use an integrative approach, combining mutant genome analysis, transcriptomics and lipid membrane composition analysis, to elucidate said mechanisms. In particular, we analyzed the genome of the high persistence mutant E. coli DS1 (hipQ), to identify candidate mutations responsible for the high persistence phenotype. Contrary to a recent study, we find no mutation in ydcI. We compared the expression of spontaneous persistent and growing cells using RNAseq, and find that the activation of stress response mechanisms is likely less important in spontaneous persistence than recent reports suggest. It also indicated that modifications in the cell membrane could play an important role. This hypothesis was then validated by the analysis of the fatty acid composition of persister cells of both types, which have markedly different saturation from growing cells and between each other. Taken together, our results indicate that changing membrane composition might be a key process in persistence. Highlights RNAseq analysis of spontaneous persistence shows no evidence of stress response Identification of candidate SNPs for hipQ phenotype, excludes ydcI Membrane fatty acid composition is involved in both types of bacterial persistence

Summary The NPR proteins function as salicylic acid (SA) receptors in Arabidopsis thaliana . AtNPR1 plays a central role in SA‐induced transcriptional reprogramming whereby positively regulates SA‐mediated defense. NPRs are found in the genomes of nearly all land plants. However, we know little about the molecular functions and physiological roles of NPRs in most plant species. We conducted phylogenetic and alignment analyses of NPRs from 68 species covering the significant lineages of land plants. To investigate NPR functions in bryophyte lineages, we generated and characterized NPR loss‐of‐function mutants in the liverwort Marchantia polymorpha . Brassicaceae NPR1‐like proteins have characteristically gained or lost functional residues identified in AtNPRs, pointing to the possibility of a unique evolutionary trajectory for the Brassicaceae NPR1‐like proteins. We find that the only NPR in M. polymorpha , MpNPR, is not the master regulator of SA‐induced transcriptional reprogramming and negatively regulates bacterial resistance in this species. The Mp npr transcriptome suggested roles of MpNPR in heat and far‐red light responses. We identify both Mp npr and At npr1‐1 display enhanced thermomorphogenesis. Interspecies complementation analysis indicated that the molecular properties of AtNPR1 and MpNPR are partially conserved. We further show that MpNPR has SA‐binding activity. NPRs and NPR‐associated pathways have evolved distinctively in diverged land plant lineages to cope with different terrestrial environments.

Summary Mitochondria are often considered the power stations of the cell, playing critical roles in various biological processes such as cellular respiration, photosynthesis, stress responses and programmed cell death. To maintain the structural and functional integrities of mitochondria, it is crucial to achieve a defined membrane lipid composition between different lipid classes wherein specific proportions of individual lipid species are present. Although mitochondria are capable of self-synthesizing a few lipid classes, many phospholipids are synthesized in the endoplasmic reticulum and transferred to mitochondria via membrane contact sites, as mitochondria are excluded from the vesicular transportation pathway. However, knowledge on the capability of lipid biosynthesis in mitochondria and the precise mechanism of maintaining the homeostasis of mitochondrial lipids is still scarce. Here we describe the lipidome of mitochondria isolated from Arabidopsis leaves, including the molecular species of glycerolipids, sphingolipids and sterols to depict the lipid landscape of mitochondrial membranes. In addition, we define proteins involved in lipid metabolism by proteomic analysis and compare our data with mitochondria from cell cultures since they still serve as model system. Proteins putatively localized to the membrane contact sites are proposed based on the proteomic results and online databases. Collectively, our results suggest that leaf mitochondria are capable - with the assistance of membrane contact site-localised proteins - of generating several lipid classes including phosphatidylethanolamines, cardiolipins, diacylgalactosylglycerols and free sterols. We anticipate our work to be a foundation to further investigate the functional roles of lipids and their involvement in biochemical reactions in plant mitochondria. One sentence summary The lipid landscape of plant mitochondria suggests that they are capable in generating several phospholipid classes with the assistant of membrane contact site-localized proteins.

Sphingolipids are essential components of plant cells, which have been notoriously difficult to study in part due to pleiotropic or lethal knock-out mutant phenotypes. By relying on alternative end-joining of double stranded breaks, we successfully used CRISPR/Cas9 mutagenesis to generate a population of diverse, viable mutant alleles of genes required for sphingolipid assembly in totipotent protoplasts of the moss Physcomitrium patens. We targeted the INOSITOL PHOSPHORYLCERAMIDE SYNTHASE (IPCS) gene family, which catalyzes the committed step in the synthesis of glycosyl inositol phosphorylceramides (GIPCs), the most abundant class of sphingolipids found in plants. We isolated knock-out single mutants and knock-down higher-order mutants showing a spectrum of deficiencies in GIPC content. Remarkably, we also identified two mutant alleles accumulating inositol phosphorylceramides, the direct products of IPCS activity, and provide our best explanation for this unexpected phenotype. Our approach is broadly applicable for studying essential genes and gene families, and for obtaining unusual lesions within a gene of interest.

Abstract Ceramides and long chain bases (LCBs) are plant sphingolipids involved in the induction of plant programmed cell death (PCD). The fatty acid hydroxylase mutant fah1 fah2 exhibits high ceramide levels and moderately elevated LCB levels. Salicylic acid (SA) is strongly induced in these mutants, but no cell death is visible. To determine the effect of ceramides with different chain lengths, fah1 fah2 was crossed with ceramide synthase mutants longevity assurance gene one homologue1-3 ( loh1 , loh2 and loh3 ). Surprisingly, only triple mutants with loh2 show a cell death phenotype under the selected conditions. Sphingolipid profiling revealed that the greatest differences between the triple mutant plants are in the LCB and LCB-phosphate (LCB-P) fraction. fah1 fah2 loh2 plants accumulate LCB d18:0 and LCB-P d18:0. Crossing fah1 fah2 loh2 with the SA synthesis mutant sid2-2 , and with the SA signaling mutants enhanced disease susceptibility 1-2 ( eds1-2 ) and phytoalexin deficient 4-1 ( pad4-1 ), revealed that lesions are SA- and EDS1-dependent. These quadruple mutants also suggest that there may be a feedback loop between SA and sphingolipid metabolism as they accumulated less ceramides and LCBs. In conclusion, PCD in fah1 fah2 loh2 is a SA and EDS1-dependent phenotype, which is likely due to accumulation of LCB d18:0.

Summary Lipid polymers such as cutin and suberin strengthen the diffusion barrier properties of the cell wall in specific cell types and are essential for water relations, mineral nutrition, and stress protection in plants. Land plant–specific glycerol-3-phosphate acyltransferases (GPATs) of different clades are central players in cutin and suberin monomer biosynthesis. Here, we show that the GPAT4 / 6 / 8 clade in Arabidopsis thaliana , which is known to mediate cutin formation, is also required for developmentally regulated root suberization, in addition to the established roles of GPAT5/7 in suberization. The GPAT5 / 7 clade is mainly required for abscisic acid–regulated suberization. In addition, the GPAT5 / 7 clade is crucial for the formation of the typical lamellated suberin ultrastructure observed by transmission electron microscopy, as distinct amorphous globular polyester structures were deposited in the apoplast of the gpat5 gpat7 double mutant, in contrast to the thinner but still lamellated suberin deposition in the gpat4 gpat6 gpat8 triple mutant. The intrinsic phosphatase activity of GPAT4, GPAT6, and GPAT8, which leads to monoacylglycerol biosynthesis, may be important for suberin biosynthesis. GPAT5/7 lack an active phosphatase domain. Notably, gpat5 gpat7 phenotypes were partially reverted by treatment with a phosphatase inhibitor or the expression of phosphatase-dead variants of GPAT4 / 6 / 8. Thus, GPATs that lack an active phosphatase domain, which are predicted to synthetize lysophosphatidic acids, might be crucial for the formation of the lamellated structure of suberin. GPATs with active and non-active phosphatase domains appear to have non-redundant functions and must cooperate to achieve the efficient biosynthesis of correctly structured suberin. Significance statement The establishment of proper lamellated suberin in roots plays essential roles in regulating mineral nutrition and water relations in plants. The basis for the macromolecular arrangement determining the ultrastructure and properties of suberin lamellae is unknown. Here, we report that both the GPAT4 / 6 / 8 and GPAT5 / 7 clades of glycerol-3-phosphate acyltransferases (GPATs) contribute to suberin formation in Arabidopsis roots. In addition, we reveal that the GPAT5 / 7 clade is required for the formation of the lamellated suberin ultrastructure. Several lines of evidence suggest that the loss of phosphatase activity in GPATs might have played a crucial role in the formation of suberin lamellae during evolution.