ABSTRACT Reductive genomic evolution, driven by genetic drift, is common in endosymbiotic bacteria. Genome reduction is less common in free-living organisms, but it has occurred in the numerically dominant open-ocean bacterioplankton Prochlorococcus and “ Candidatus Pelagibacter,” and in these cases the reduction appears to be driven by natural selection rather than drift. Gene loss in free-living organisms may leave them dependent on cooccurring microbes for lost metabolic functions. We present the Black Queen Hypothesis (BQH), a novel theory of reductive evolution that explains how selection leads to such dependencies; its name refers to the queen of spades in the game Hearts, where the usual strategy is to avoid taking this card. Gene loss can provide a selective advantage by conserving an organism’s limiting resources, provided the gene’s function is dispensable. Many vital genetic functions are leaky, thereby unavoidably producing public goods that are available to the entire community. Such leaky functions are thus dispensable for individuals, provided they are not lost entirely from the community. The BQH predicts that the loss of a costly, leaky function is selectively favored at the individual level and will proceed until the production of public goods is just sufficient to support the equilibrium community; at that point, the benefit of any further loss would be offset by the cost. Evolution in accordance with the BQH thus generates “beneficiaries” of reduced genomic content that are dependent on leaky “helpers,” and it may explain the observed nonuniversality of prototrophy, stress resistance, and other cellular functions in the microbial world.

The phytoplankton community in the oligotrophic open ocean is numerically dominated by the cyanobacterium Prochlorococcus, accounting for approximately half of all photosynthesis. In the illuminated euphotic zone where Prochlorococcus grows, reactive oxygen species are continuously generated via photochemical reactions with dissolved organic matter. However, Prochlorococcus genomes lack catalase and additional protective mechanisms common in other aerobes, and this genus is highly susceptible to oxidative damage from hydrogen peroxide (HOOH). In this study we showed that the extant microbial community plays a vital, previously unrecognized role in cross-protecting Prochlorococcus from oxidative damage in the surface mixed layer of the oligotrophic ocean. Microbes are the primary HOOH sink in marine systems, and in the absence of the microbial community, surface waters in the Atlantic and Pacific Ocean accumulated HOOH to concentrations that were lethal for Prochlorococcus cultures. In laboratory experiments with the marine heterotroph Alteromonas sp., serving as a proxy for the natural community of HOOH-degrading microbes, bacterial depletion of HOOH from the extracellular milieu prevented oxidative damage to the cell envelope and photosystems of co-cultured Prochlorococcus, and facilitated the growth of Prochlorococcus at ecologically-relevant cell concentrations. Curiously, the more recently evolved lineages of Prochlorococcus that exploit the surface mixed layer niche were also the most sensitive to HOOH. The genomic streamlining of these evolved lineages during adaptation to the high-light exposed upper euphotic zone thus appears to be coincident with an acquired dependency on the extant HOOH-consuming community. These results underscore the importance of (indirect) biotic interactions in establishing niche boundaries, and highlight the impacts that community-level responses to stress may have in the ecological and evolutionary outcomes for co-existing species.

ABSTRACT Heavy metals (HMs) are known to modify bacterial communities both in the laboratory and in situ . As a consequence, soils in HM contaminated sites like the U.S. Environmental Protection Agency (EPA) Superfund sites are predicted to have altered ecosystem functioning, with potential ramifications for the health of organisms, including humans, that live nearby. Further, several studies have shown that metal tolerant bacteria are often also resistant to antimicrobial agents (AMR), and therefore HM contaminated soils could potentially act as reservoirs that could disseminate AMR genes into human-associated pathogenic bacteria. To explore this possibility soil samples were collected from six public locations in the zip code 35207 (the home of the North Birmingham 35 th Avenue Superfund site) and in six public areas in a neighboring reference zip code (35214). Sequencing of the V4 region of the bacterial 16S rRNA gene revealed that elevated concentrations of HMs As, Mn, Pb, and Zn reduced microbial diversity and altered community structure within each zip code. While there was no difference between zip codes in the proportion of total culturable microbes that survived antimicrobial or metal exposure, bacterial isolates with HMR almost always also exhibited AMR. Metagenomes inferred using PICRUST2 also predicted significantly higher mean relative frequencies in 35207 for several AMR genes related to both specific and broad-spectrum AMR phenotypes. Together, these results support the hypothesis that chronic HM pollution alters soil bacterial community structure in ecologically meaningful ways and may also select for bacteria with increased potential to contribute to AMR in human bacterial disease.

ABSTRACT Anthropogenic CO 2 emissions are projected to lower the pH of the open ocean by 0.2 to 0.3 units over the next century. Laboratory experiments show that different phytoplankton taxa exhibit a wide variety of responses, with some strains having higher fitness under projected future conditions, and others being negatively impacted. Previous studies have suggested that Prochlorococcus and Synechococcus , the numerically dominant picophytoplankton in the oceans, have very different responses to elevated CO 2 that may result in a dramatic shift in their relative abundances in future oceans. Here we show that these two genera experience faster exponential growth rates under future CO 2 conditions, similar to most other cyanobacteria that have been studied. However, Prochlorococcus strains have significantly lower realized growth rates due to more extreme lag periods after exposure to fresh culture media. Surprisingly, however, Synechococcus was unable to outcompete Prochlorococcus in co-culture at elevated CO 2 . Under these conditions, Prochlorococcus ’ poor response to elevated CO 2 disappeared, and it showed negative frequency dependence in its relative fitness compared to Synechococcus , with a significant fitness advantage when it was initially rare. Moreover, both Synechococcus and Prochlorococcus had faster growth rates in co-culture with each other than either had in unialgal culture. We speculate that this negative frequency dependence is an outgrowth of reductive Black Queen evolution operating on both taxa that has resulted in a passively mutualistic relationship analogous to that connecting Prochlorococcus with the “helper” heterotrophic microbes in its environment.

Many populations live in environments subject to frequent biotic and abiotic changes. Nonetheless, it is interesting to ask whether an evolving population's mean fitness can increase indefinitely, and potentially without any limit, even in a constant environment. A recent study showed that fitness trajectories of Escherichia coli populations over 50,000 generations were better described by a power-law model than by a hyperbolic model. According to the power-law model, the rate of fitness gain declines over time but fitness has no upper limit, whereas the hyperbolic model implies a hard limit. Here, we examine whether the previously estimated power-law model predicts the fitness trajectory for an additional 10,000 generations. To that end, we conducted more than 1100 new competitive fitness assays. Consistent with the previous study, the power-law model fits the new data better than the hyperbolic model. We also analysed the variability in fitness among populations, finding subtle, but significant, heterogeneity in mean fitness. Some, but not all, of this variation reflects differences in mutation rate that evolved over time. Taken together, our results imply that both adaptation and divergence can continue indefinitely-or at least for a long time-even in a constant environment.

The study of microbial evolution is hindered by the fact that microbial populations leave few fossils. We hypothesized that bacterial cells preserved in ancient ice could be used as a molecular fossil record if their DNA could be extracted and sequenced. Channels formed along triple junctions of ice crystals contain liquid “veins” in which microbial cells may be preserved intact. Since vertical motion through the ice matrix is impossible, microbes found in ice cores are representative of microbes present at the time the ice was formed. We detected chlorophyll fluorescence in intact ice cores taken from Greenland and Antarctica. Flow cytometric analysis localized at least some of this fluorescence to particles < 1 μm in diameter. Metagenomic analysis of meltwater indeed revealed sequences similar to modern strains of the picocyanobacterial genera Synechococcus and Prochlorococcus, and some of these sequences were distinct from any sequences known from modern oceans or glacial environments. Our study is a first proof-of-concept of the use of ice cores as records of microbial evolution, and we suggest that future genetic studies with higher vertical resolution in the cores might shed light on the pace and character of evolution of these ecologically important cells.

ABSTRACT The CO 2 content of Earth’s atmosphere is rapidly increasing due to human consumption of fossil fuels. Models based on short-term culture experiments predict that major changes will occur in marine phytoplankton communities in the future ocean, but these models rarely consider how the evolutionary potential of phytoplankton or interactions within marine microbial communities may influence these changes. Here we experimentally evolved representatives of four phytoplankton functional types (silicifiers, calcifiers, coastal cyanobacteria, and oligotrophic cyanobacteria) in co-culture with a heterotrophic bacterium, Alteromonas , under either present-day or predicted future pCO 2 conditions. Growth rates of cyanobacteria generally increased under both conditions, and the growth defects observed in ancestral Prochlorococcus cultures at elevated pCO 2 and in axenic culture were diminished after evolution, possibly due to regulatory mutations in antioxidant genes. Except for Prochlorococcus , mutational profiles suggested phytoplankton experienced primarily purifying selection, but most Alteromonas lineages showed evidence of directional selection, especially when co-cultured with eukaryotic phytoplankton, where evolution appeared to favor a broad metabolic switch from growth on small organic acids to catabolism of more complex carbon substrates. Evolved Alteromonas were also poorer “helpers” for Prochlorococcus , supporting the assertion that the interaction between Prochlorococcus and heterotrophic bacteria is not a true mutualism but rather a competitive interaction stabilized by Black Queen processes. This work provides new insights on how phytoplankton will respond to anthropogenic change and on the evolutionary mechanisms governing the structure and function of marine microbial communities.