Mitochondrial Ca 2+ efflux is linked to numerous cellular activities and pathophysiological processes. Although it is established that an Na + -dependent mechanism mediates mitochondrial Ca 2+ efflux, the molecular identity of this transporter has remained elusive. Here we show that the Na + /Ca 2+ exchanger NCLX is enriched in mitochondria, where it is localized to the cristae. Employing Ca 2+ and Na + fluorescent imaging, we demonstrate that mitochondrial Na + -dependent Ca 2+ efflux is enhanced upon overexpression of NCLX, is reduced by silencing of NCLX expression by siRNA, and is fully rescued by the concomitant expression of heterologous NCLX. NCLX-mediated mitochondrial Ca 2+ transport was inhibited, moreover, by CGP-37157 and exhibited Li + dependence, both hallmarks of mitochondrial Na + -dependent Ca 2+ efflux. Finally, NCLX-mediated mitochondrial Ca 2+ exchange is blocked in cells expressing a catalytically inactive NCLX mutant. Taken together, our results converge to the conclusion that NCLX is the long-sought mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger.

Summary Mitochondrial metabolism is critical for brain function. However, the mechanisms linking mitochondrial energy production to neuronal activity are elusive. Using whole-cell electrical recordings from Layer 5 pyramidal neurons in cortical slices and fluorescence imaging of cytosolic, mitochondrial Ca 2+ indicators and endogenous NAD(P)H, we revealed ultra-fast, spike-evoked mitochondrial Ca 2+ transients temporally similar to cytosolic Ca 2+ elevations. We demonstrate that, whereas single or few spikes elicit the mitochondrial Ca 2+ transients throughout the cell, their amplitude is differentially regulated in distinct neuronal compartments. Thus, these signals were prominent in the soma and apical dendrites and ∼3 times smaller in basal dendrites and axons. The spike firing frequency had a subtle effect on the amplitude of the cytosolic Ca 2+ elevations but dramatically affected mitochondrial Ca 2+ transients and NAD(P)H oxidation and recovery rates. Moreover, while subthreshold EPSPs alone caused no detectable Ca 2+ elevation in dendritic mitochondria, the Hebbian coincidence of unitary EPSP and postsynaptic spike produced a localized, single mitochondrial Ca 2+ elevation. These findings suggest that neuronal mitochondria are uniquely capable of decoding firing frequency and EPSP-to-spike time intervals for tuning the metabolic rate and triggering changes in synaptic efficacy.

Summary Despite the established role of mitochondria in tumorigenesis, the molecular mechanisms by which mitochondrial Ca 2+ (mtCa 2+ ) signaling regulates tumor growth and metastasis remain unknown. The crucial role of mtCa 2+ in tumorigenesis is highlighted by the altered expression of proteins mediating mtCa 2+ uptake and extrusion in cancer cells. Here, we demonstrate that expression of the mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger NCLX ( SLC8B1 ) is decreased in colorectal tumors and is associated with advanced-stage disease in patients. We reveal that downregulation of NCLX leads to mtCa 2+ overload, mitochondrial depolarization, mitophagy, and reduced tumor size. Concomitantly, NCLX downregulation drives metastatic spread, chemoresistance, the expression of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), hypoxia, and stem cell pathways. Mechanistically, mtCa 2+ overload leads to an increase in mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) which activates HIF1α signaling supporting the metastatic behavior of tumor cells lacking NCLX. Our results reveal that loss of NCLX expression is a novel driver of metastatic progression, indicating that control of mtCa 2+ levels is a novel therapeutic approach in metastatic colorectal cancer. Highlights The expression of NCLX is decreased in colorectal tumors and is associated with advanced-stage disease in patients. NCLX plays a dichotomous role in colorectal tumor growth and metastasis. NCLX downregulation causes mitophagy and reduced colorectal cancer tumor growth. NCLX downregulation induces stemness, chemoresistance and metastasis through mtCa 2+ /ROS/HIF1α signaling axis. Graphical Abstract Significance Mitochondrial Ca 2+ (mtCa 2+ ) homeostasis is essential for cellular metabolism and growth and plays a critical role in cancer progression. mtCa 2+ uptake is mediated by an inner membrane protein complex containing the mitochondrial Ca 2+ uniporter (MCU). mtCa 2+ uptake by the MCU is followed by a ∼100-fold slower mtCa 2+ extrusion mediated by the inner mitochondrial membrane ion transporter, the mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger NCLX. Because NCLX is a slower transporter than the MCU, it is a crucial rate-limiting factor of mtCa 2+ homeostasis that cannot easily be compensated by another Ca 2+ transport mechanism. This represents the first study investigating the role of NCLX in tumorigenesis and metastasis. We demonstrate for the first time that colorectal cancers exhibit loss of NCLX expression and that this is associated with advanced-stage disease. Intriguingly, decreased NCLX function has a dichotomous role in colorectal cancer. Thus, we reveal that NCLX loss leads to reduced primary tumor growth and overall tumor burden in vivo . Yet, the consequential increases in mtCa 2+ elicit pro-survival, hypoxic and gene transcription pathways that enhance metastatic progression. This dichotomy is a well-established feature of chemoresistant and recurrent tumor cells including cancer stem cells. Moreover, the downstream changes elicited by NCLX loss are reminiscent of mesenchymal colorectal cancer subtypes that display poor patient survival. Our data indicate that the demonstrated changes to the mtCa 2+ /mtROS/HIF1α signaling axis elicited through the loss of NCLX are a key adaptation and driver of metastatic colorectal cancer.

Hepatic Ca2+ signaling has been identified as a crucial key factor in driving gluconeogenesis. The involvement of mitochondria in hormone-induced Ca2+ signaling and their contribution to metabolic activity remain, however, poorly understood. Moreover, the molecular mechanism governing the mitochondrial Ca2+ efflux signaling remains unresolved. This study investigates the role of the Na+/Ca2+ exchanger, NCLX, in modulating hepatic mitochondrial Ca2+ efflux, and examines its physiological significance in hormonal hepatic Ca2+ signaling, gluconeogenesis, and mitochondrial bioenergetics. Primary mouse hepatocytes from both an AAV-mediated conditional hepatic-specific and a total mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger, NCLX, knockout (KO) mouse models were employed for fluorescent monitoring of purinergic and glucagon/vasopressin-dependent mitochondrial and cytosolic hepatic Ca2+ responses in cultured hepatocytes. Isolated liver mitochondria and permeabilized primary hepatocytes were used to analyze the ion-dependence of Ca2+ efflux. Utilizing the conditional hepatic-specific NCLX KO model, the rate of gluconeogenesis was assessed by first monitoring glucose levels in fasted mice, and subsequently subjecting the mice to a pyruvate tolerance test while monitoring their blood glucose. Additionally, cultured primary hepatocytes from both genotypes were assessed in vitro for glucagon-dependent glucose production and cellular bioenergetics through glucose oxidase assay and Seahorse respirometry, respectively. Analysis of Ca2+ responses in isolated liver mitochondria and cultured primary hepatocytes from NCLX KO versus WT mice showed that NCLX serves as the principal mechanism for mitochondrial calcium extrusion in hepatocytes. We then determined the role of NCLX in glucagon and vasopressin-induced Ca2+ oscillations. Consistent with previous studies, glucagon and vasopressin triggered Ca2+ oscillations in WT hepatocytes, however, the deletion of NCLX resulted in selective elimination of mitochondrial, but not cytosolic, Ca2+ oscillations, underscoring NCLX's pivotal role in mitochondrial Ca2+ regulation. Subsequent in vivo investigation for hepatic NCLX role in gluconeogenesis revealed that, as opposed to WT mice which maintained normoglycemic blood glucose levels when fasted, conditional hepatic-specific NCLX KO mice exhibited a faster drop in glucose levels, becoming hypoglycemic. Furthermore, KO mice showed deficient conversion of pyruvate to glucose when challenged under fasting conditions. Concurrent in vitro assessments showed impaired glucagon-dependent glucose production and compromised bioenergetics in KO hepatocytes, thereby underscoring NCLX's significant contribution to hepatic glucose metabolism. The study findings demonstrate that NCLX acts as the primary Ca2+ efflux mechanism in hepatocytes. NCLX is indispensable for regulating hormone-induced mitochondrial Ca2+ oscillations, mitochondrial metabolism, and sustenance of hepatic gluconeogenesis.

Abstract Impairments in neural lysosomal- and autophagic-mediated degradation of cellular debris contribute to neuritic dystrophy and synaptic loss. While these are well-characterized features of neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease (AD), the upstream cellular processes driving deficits in pathogenic protein mishandling are less understood. Using a series of fluorescent biosensors and optical imaging in model cells, AD mouse models and human neurons derived from AD patients, we reveal a novel cellular signaling cascade underlying protein mishandling mediated by intracellular calcium dysregulation, an early component of AD pathogenesis. Increased Ca 2+ release via the endoplasmic reticulum (ER) resident ryanodine receptor (RyR) is associated with reduced expression of the lysosome proton pump vATPase subunits (V1B2 and V0a1), resulting in lysosome deacidification and disrupted proteolytic activity in AD mouse models and human induced neurons (HiN). As a result of impaired lysosome digestive capacity, mature autophagosomes with hyperphosphorylated tau accumulated in AD murine neurons and AD HiN, exacerbating proteinopathy. Normalizing AD-associated aberrant RyR-Ca 2+ signaling with the negative allosteric modulator, dantrolene (Ryanodex), restored vATPase levels, lysosomal acidification and proteolytic activity, and autophagic clearance of intracellular protein aggregates in AD neurons. These results highlight that prior to overt AD histopathology or cognitive deficits, aberrant upstream Ca 2+ signaling disrupts lysosomal acidification and contributes to pathological accumulation of intracellular protein aggregates. Importantly, this is demonstrated in animal models of AD, and in human iPSC-derived neurons from AD patients. Furthermore, pharmacological suppression of RyR-Ca 2+ release rescued proteolytic function, revealing a target for therapeutic intervention that has demonstrated effects in clinically-relevant assays. Significance Statement We demonstrate in model cells, murine neuronal cultures, and iPSC-derived human neurons, that AD associated RyR-Ca 2+ dyshomeostasis impairs lysosomal acidification, lysosomal proteolytic activity and hinders autophagic-mediated protein aggregate clearance, which are processes vital to neuronal survival. These deficits were reversed by restoring intracellular Ca 2+ homeostasis. Notably, this provides a therapeutic target and emphasizes the pathogenic relationship between ER-Ca 2+ handling, that is known to be altered in AD, to pathogenic protein accumulation as a critical turning point in early stages of Alzheimer’s disease.

Tight regulation of mitochondrial Ca2+ is essential for neuronal bioenergetics and cellular metabolism. Ca2+ transfer from ER-localized ryanodine receptors (RyR) and inositol triphosphate receptors (IP3R) to the mitochondria maintains a steady Ca2+ source that fuels oxidative phosphorylation and ATP production. In Alzheimer's disease (AD), RyR-evoked Ca2+ release is markedly increased, contributing to synaptic deficits, protein mishandling, and memory impairment. Here, we demonstrate that dysregulated RyR-Ca2+ release directly compromises mitochondrial activity and is an early contributor to AD cellular pathology. We measured an array of mitochondrial functions using fluorescent biosensors and optical imaging in RyR2-expressing HEK cells and iPSC-derived neurons from familial AD and nonAD patients. In neurons from AD patients, resting mitochondrial Ca2+ levels were elevated alongside increased free radical production and higher caspase-3 activity relative to nonAD neurons. RyR-evoked Ca2+ release further potentiated pathogenic mitochondrial responses in AD neurons, with increased Ca2+ uptake and exaggerated membrane depolarization. Additionally, clearance of damaged mitochondria was impaired in AD neurons, demonstrating consequences from dysfunctional lysosomes. Notably, impairments to mitochondria in AD neurons were largely prevented with the RyR negative allosteric modulator, Ryanodex. These findings highlight how excess RyR-Ca2+ release broadly contributes to early cellular pathology in AD which includes a cascade of ER, lysosomal, and mitochondrial deficits culminating in neuronal decline and degeneration. Additionally, pharmacological suppression of RyR-Ca2+ release preserves mitochondrial, ER and lysosomal function, thus providing a novel and effective therapeutic.

A sharp increase in mitochondrial Ca2+ marks the activation of the brown adipose tissue (BAT) thermogenesis, yet the mechanisms preventing Ca2+ deleterious effects are poorly understood. Here, we show that adrenergic stimulation of BAT activates a PKA-dependent mitochondrial Ca2+ extrusion via the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger, NCLX. Adrenergic stimulation of NCLX-ablated brown adipocytes (BA) induces a profound mitochondrial Ca2+ overload and impaired uncoupled respiration. Core body temperature, PET imaging and VO2 measurements confirm a BAT specific thermogenic defect in NCLX-null mice. We show that mitochondrial Ca2+ overload induced by adrenergic stimulation of NCLX-null BAT, triggers the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), leading to remarkable mitochondrial swelling, Cytochrome c release and cell death in BAT. However, treatment with mPTP inhibitors rescue mitochondrial respiratory function and thermogenesis in NCLX-null BA, in vitro and in vivo. Our findings identify a novel pathway enabling non-lethal mitochondrial Ca2+ elevation during adrenergic stimulation of uncoupled respiration. Deletion of NCLX transforms the adrenergic pathway responsible for the stimulation of thermogenesis into a death pathway.

Cellular Zn2+ homeostasis is tightly regulated and primarily mediated by designated Zn2+ transport proteins, namely ZnTs (SLC30) that shuttle Zn2+ efflux, and ZIPs (SLC39) that mediate Zn2+ influx. While the functional determinants of ZnT-mediated Zn2+ efflux are elucidated, those of ZIP transporters are lesser understood. Previous work has suggested three distinct molecular mechanisms: (I) HCO3- or (II) H+ coupled Zn2+ transport, or (III) a pH regulated electrodiffusional mode of transport. Here, using live-cell fluorescent imaging of Zn2+ and H+, in cells expressing ZIP4, we set out to interrogate its function. Intracellular pH changes or the presence of HCO3- failed to induce Zn2+ influx. In contrast, extracellular acidification stimulated ZIP4 dependent Zn2+ uptake. Furthermore, Zn2+ uptake was coupled to enhanced H+ influx in cells expressing ZIP4, thus indicating that ZIP4 is not acting as a pH regulated channel but rather as an H+ powered Zn2+ co-transporter. We further illustrate how this functional mechanism is affected by genetic variants in SLC39A4 that in turn lead to Acrodermatitis Enteropathica, a rare condition of Zn2+ deficiency.

Abstract Hepatic Ca 2+ signaling is emerging as a key factor in mediating gluconeogenesis. However, the identity of the hepatic mitochondrial Ca 2+ transporter is controversial and the role of mitochondria in controlling hormonal Ca 2+ signaling and linking them to metabolic activity is poorly understood. We first interrogated the role of the mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger NCLX by triggering cytosolic Ca 2+ purinergic signaling in primary hepatocytes, and Ca 2+ responses in isolated mitochondria from WT, global NCLX KO, and conditional hepatic NCLX KO mice models. We monitored a higher rate of Na + -dependent mitochondrial Ca 2+ efflux in NCLX-expressing hepatocytes, indicating that it constitutes the major Ca 2+ efflux pathway. We then asked if NCLX is controlling the hormone-dependent mitochondrial Ca 2+ oscillations by employing physiological concentrations of glucagon and vasopressin. Consistent with previous studies, hormone applications triggered mitochondrial Ca 2+ oscillations in WT hepatocytes. In NCLX KO hepatocytes the cytosolic oscillations persisted, however, the mitochondrial Ca 2+ oscillations were suppressed. To further understand the metabolic role of NCLX in the hepatic system, we examined gluconeogenic function in vivo and ex vitro by monitoring hepatic glucose production. We found that blood glucose dropped faster in the conditional KO mice and their hepatic glucagon-dependent glucose production was reduced, indicating that gluconeogenesis was impaired in hepatic conditional NCLX KO mice. Taken together, our results indicate that NCLX is the primary Ca 2+ extruder in hepatocytes and is required for mediating the hormone-dependent mitochondrial Ca 2+ oscillations and gluconeogenesis. Significance Hepatic Ca 2+ signaling is crucial for gluconeogenesis, but the mitochondrial control of this process is not resolved. This study identifies the mitochondrial transporter, NCLX, as a critical link between hormonal-dependent mitochondrial Ca 2+ oscillations and gluconeogenesis. We first show that NCLX is the major hepatic mitochondrial efflux pathway. We then demonstrate that NCLX is required for glucagon-dependent mitochondrial Ca 2+ oscillations and the acceleration of mitochondrial oxidative function. Using a conditional hepatic NCLX-null mouse model, we show that NCLX is required for maintaining hepatic glucose production during fasting and in response to glucagon stimulation. Overall, the study identifies NCLX as the integrator of hepatic mitochondrial Ca 2+ signaling, required for gluconeogenesis.