The CXCR4-SDF-1 axis plays a central role in the trafficking and retention of normal and malignant stem cells in the bone marrow (BM) microenvironment. Here, we used a mouse model of acute promyelocytic leukemia (APL) and a small molecule competitive antagonist of CXCR4, AMD3100, to examine the interaction of mouse APL cells with the BM microenvironment. APL cells from a murine cathepsin G-PML-RARalpha knockin mouse were genetically modified with firefly luciferase (APL(luc)) to allow tracking by bioluminescence imaging. Coculture of APL(luc) cells with M2-10B4 stromal cells protected the leukemia cells from chemotherapy-induced apoptosis in vitro. Upon injection into syngeneic recipients, APL(luc) cells rapidly migrated to the BM followed by egress to the spleen then to the peripheral blood with death due to leukostasis by day 15. Administration of AMD3100 to leukemic mice induced a 1.6-fold increase in total leukocytes and a 9-fold increase of circulating APL blast counts, which peak at 3 hours and return to baseline by 12 hours. Treatment of leukemic mice with chemotherapy plus AMD3100 resulted in decreased tumor burden and improved overall survival compared with mice treated with chemotherapy alone. These studies provide a proof-of-principle for directing therapy to the critical tethers that promote AML-niche interactions.

T cell malignancies represent a group of hematologic cancers with high rates of relapse and mortality in patients for whom no effective targeted therapies exist. The shared expression of target antigens between chimeric antigen receptor (CAR) T cells and malignant T cells has limited the development of CAR-T because of unintended CAR-T fratricide and an inability to harvest sufficient autologous T cells. Here, we describe a fratricide-resistant "off-the-shelf" CAR-T (or UCART7) that targets CD7+ T cell malignancies and, through CRISPR/Cas9 gene editing, lacks both CD7 and T cell receptor alpha chain (TRAC) expression. UCART7 demonstrates efficacy against human T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) cell lines and primary T-ALL in vitro and in vivo without the induction of xenogeneic GvHD. Fratricide-resistant, allo-tolerant "off-the-shelf" CAR-T represents a strategy for treatment of relapsed and refractory T-ALL and non-Hodgkin's T cell lymphoma without a requirement for autologous T cells.

Abstract Chimeric antigen receptor (CAR)-based therapies have pioneered synthetic cellular immunity against cancer, however remain limited in their scope and long-term efficacy. Emerging data suggest that dysregulated CAR-driven T cell activation causes T cell dysfunction and therapeutic failure. To re-engage the endogenous T cell response, we designed hybrid MHC-independent T cell receptors (miTCRs) by linking antibody variable domains to TCR constant domains. While functional, we observed stark differences in miTCR-driven T cell function that were dependent on receptor orientation. Using predictive structural modeling, we observed significant biochemical conflicts at the hybrid variable-constant domain interface. To overcome this, we performed iterative sequence modifications and structural modeling to design a panel of miTCR variants predicted to have improved interface stability. Functional screening nominated a variant with superior efficacy to all other miTCRs as well as a standard CAR against high burdens of leukemia. Statement of Significance Improving the durability of engineered T cell immunotherapies is critical to enhancing efficacy. We used structure-informed design to evolve MHC-independent T cell receptors that drive improved tumor control. This work underscores the central role of synthetic receptor structure on T cell function and provides a framework for improved receptor engineering.

ABSTRACT Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) conditioning using antibody-drug conjugates (ADC) is a promising alternative to conventional chemotherapy- and irradiation-based conditioning regimens. The drug payload bound to an ADC is a key contributor to its efficacy and potential toxicities; however, a comparison of HSCT conditioning ADCs produced with different toxic payloads has not been performed. Indeed, ADC optimization studies in general are hampered by the inability to produce and screen multiple combinations of antibody and drug payload in a rapid, cost-effective manner. Herein, we used Click chemistry to covalently conjugate four different small molecule payloads to streptavidin; these streptavidin-drug conjugates can then be joined to any biotinylated antibody to produce stable, indirectly conjugated ADCs. Evaluating CD45-targeted ADCs produced with this system, we found the pyrrolobenzodiazepine (PBD) dimer SGD-1882 was the most effective payload for targeting mouse and human hematopoietic stem cells (HSCs) and acute myeloid leukemia cells. In murine syngeneic HSCT studies, a single dose of CD45-PBD enabled near-complete conversion to donor hematopoiesis. Finally, human CD45-PBD provided significant antitumor benefit in a patient-derived xenograft model of acute myeloid leukemia. As our streptavidin-drug conjugates were generated in-house with readily accessible equipment, reagents, and routine molecular biology techniques, we anticipate this flexible platform will facilitate the evaluation and optimization of ADCs for myriad targeting applications.

ABSTRACT Despite the curative potential of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), transplant conditioning-associated toxicities preclude broader clinical application. Antibody-drug conjugates (ADC) provide an attractive approach to HSCT conditioning that minimizes toxicity while retaining efficacy. Initial studies of ADC conditioning have largely involved syngeneic HSCT; however, for treatment of acute leukemias or tolerance induction for solid organ transplantation, strategies for allogeneic HSCT (allo-HSCT) are needed. Using murine allo-HSCT models, we show that combining CD45-targeted ADCs with the Janus kinase inhibitor baricitinib enables multilineage alloengraftment with >80-90% donor chimerism. Mechanistically, baricitinib impaired T and NK cell survival, proliferation and effector function, with NK cells being particularly susceptible due to inhibited IL-15 signaling. Unlike irradiated mice, CD45-ADC-conditioned mice did not manifest graft-versus-host alloreactivity when challenged with mismatched T cells. Our studies demonstrate novel allo-HSCT conditioning strategies that exemplify the promise of immunotherapy to improve the safe application of HSCT for treating hematologic diseases.