Understanding how intra-tumoral immune populations coordinate to generate anti-tumor responses following therapy can guide precise treatment prioritization. We performed systematic dissection of an established adoptive cellular therapy, donor lymphocyte infusion (DLI), by analyzing 348,905 single-cell transcriptomes from 74 longitudinal bone-marrow samples of 25 patients with relapsed myeloid leukemia; a subset was evaluated by protein-based spatial analysis. In acute myelogenous leukemia (AML) responders, diverse immune cell types within the bone-marrow microenvironment (BME) were predicted to interact with a clonally expanded population of ZNF683 + GZMB + CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) which demonstrated in vitro specificity for autologous leukemia. This population, originating predominantly from the DLI product, expanded concurrently with NK and B cells. AML nonresponder BME revealed a paucity of crosstalk and elevated TIGIT expression in CD8+ CTLs. Our study highlights recipient BME differences as a key determinant of effective anti-leukemia response and opens new opportunities to modulate cell-based leukemia-directed therapy.

Resistance to the graft-versus-leukemia (GvL) effect remains the major barrier to successful allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) for aggressive hematologic malignancies. The basis of GvL resistance for advanced lymphoid malignancies remains incompletely understood. We hypothesized that for patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) treated with allo-HSCT, leukemic cell-intrinsic features shape GvL outcomes by directing the evolutionary trajectories of CLL cells. Integrated genetic, transcriptomic and epigenetic analyses of CLL cells from 10 patients revealed that the clinical kinetics of post-HSCT relapse are shaped by distinct molecular dynamics and suggest that the selection pressures of the GvL bottleneck are unlike those imposed by chemotherapy. No selective advantage for HLA loss was observed, even when present in pre-transplant subpopulations. Regardless of post-transplant relapse kinetics, gain of stem cell modules was a common signature associated with leukemia relapse. These data elucidate the biological pathways that underlie GvL resistance and post-transplant relapse.### Competing Interest StatementC.J.W. is a co-founder of Neon Therapeutics and member of its scientific advisory board. C.J.W., G.G., D.N. and T.J.K. receive research funding from Pharmacyclics. T.J.K. has received research funding and/or has served as an advisor to Ascerta/AstraZeneca, Celgene, Genentech/Roche, Gilead, Janssen, Loxo Oncology, Octernal Therapeutics, Pharmacyclics/AbbVie, TG Therapeutics, VelosBio, and Verastem. Cirmtuzumab was developed by T.J.K. and licensed by the University of California to Oncternal Therapeutics, Inc., which has provided stock/options to the university and T.J.K. G.G. receives research funds from IBM. G.G. is an inventor of several bioinformatics-related patents, including patents related to MuTect and ABSOLUTE. J.R.B. is a consultant for Abbvie, Acerta, Beigene, Genentech/Roche, Gilead, Juno/Celgene, Kite, Loxo, Novartis, Pfizer, Pharmacyclics, Sunesis, TG Therapeutics and Verastem; received honoraria from Janssen and Teva; received research funding from Gilead, Loxo, Sun and Verastem; and served on data safety monitoring committees for Morphosys and Invectys. S.A.S. previously advised and has received consulting fees from Neon Therapeutics. S.A.S. reported nonfinancial support from Bristol-Myers Squibb, and equity in Agenus Inc., Agios Pharmaceuticals, Breakbio Corp., Bristol-Myers Squibb and NewLink Genetics, outside the submitted work. D.N. reports stock ownership in Madrigal Pharmaceuticals. J.R. receives research funding from Amgen, Equillium and Kite/Gilead and serves on Data Safety Monitoring Committees for AvroBio and Scientific Advisory Boards for LifeVault Bio, Rheos Medicines, Talaris Therapeutics and TScan Therapeutics. P.V.K. serves on the Scientific Advisory Board to Celsius Therapeutics Inc. The remaining authors declare no competing financial interests.

Immune therapies have transformed the cancer therapeutic landscape but fail to benefit most patients. To elucidate the underlying mechanisms by which T cells mediate elimination of leukemia, we generated a high-resolution map of longitudinal T cell dynamics within the same tumor microenvironment (TME) during response or resistance to donor lymphocyte infusion (DLI), a widely used immunotherapy for relapsed leukemia. We analyzed 87,939 bone marrow-derived single T cell transcriptomes, along with chromatin accessibility and single T cell receptor clonality profiles, by developing novel machine learning tools for integrating longitudinal and multimodal data. We found that pre-treatment enrichment and post-treatment rapid, durable expansion of ‘terminal’ (T EX ) and ‘precursor’ (T PEX ) exhausted subsets, respectively, defined DLI response. A contrasting, heterogeneous pattern of T cell dysfunction marked DLI resistance. Unexpectedly, T PEX cells that expanded in responders did not arise from the infusion product but instead from both pre-existing and novel clonotypes recruited to the TME. Our unbiased dissection of the TME using a Bayesian method, Symphony, defined the T cell circuitry underlying effective human anti-leukemic immune responses that may be broadly relevant to other exhaustion antagonists across cancers. Finally, we provide a general analysis paradigm for exploiting temporal single-cell genomic profiling for deep understanding of therapeutic scenarios beyond oncology.