Abstract Capturing mitochondria’s intricate and dynamic structure poses a daunting challenge for optical nanoscopy. Different labeling strategies have been demonstrated for live-cell stimulated emission depletion (STED) microscopy of mitochondria, but orthogonal strategies are yet to be established, and image acquisition has suffered either from photodamage to the organelles or from rapid photobleaching. Therefore, live-cell nanoscopy of mitochondria has been largely restricted to 2D single-color recordings of cancer cells. Here, by conjugation of cyclooctatetraene to a benzo-fused cyanine dye, we report a mitochondrial inner-membrane (IM) fluorescent marker, PK Mito Orange (PKMO), featuring efficient STED at 775 nm, strong photostability and markedly reduced phototoxicity. PKMO enables super-resolution recordings of inner-membrane dynamics for extended periods in immortalized mammalian cell lines, primary cells, and organoids. Photostability and reduced phototoxicity of PKMO open the door to live-cell 3D STED nanoscopy of mitochondria for three-dimensional analysis of the convoluted IM. PKMO is optically orthogonal with green and far-red markers allowing multiplexed recordings of mitochondria using commercial STED microscopes. Using multi-color STED, we demonstrate that imaging with PKMO can capture the sub-mitochondrial localization of proteins, or interactions of mitochondria with different cellular components, such as the ER or the cytoskeleton at sub-100 nm resolution. Thereby, this work offers a versatile tool for studying mitochondrial inner-membrane architecture and dynamics in a multiplexed manner.

Abstract Rhodamines have been continuously optimized in brightness, biocompatibility, and colors to fulfill the demands of modern bioimaging. However, the problem of phototoxicity caused by the excited fluorophore under long-term illumination has been largely neglected, hampering their use in time-lapse imaging. Here we introduce cyclooctatetraene (COT) conjugated rhodamines that span the visible spectrum and exhibit significantly reduced phototoxicity. We identified a general strategy for the generation of Gentle Rhodamines, which preserved their outstanding spectroscopic properties and cell permeability while showing an efficient reduction of singlet-oxygen formation and diminished cellular photodamage. Paradoxically, their photobleaching kinetics do not go hand in hand with reduced phototoxicity. By combining COT-conjugated spirocyclization motifs with targeting moieties, these gentle rhodamines compose a toolkit for time-lapse imaging of mitochondria, DNA, and actin and synergize with covalent and exchangeable HaloTag labeling of cellular proteins with less photodamage than their commonly used precursors. Taken together, the Gentle Rhodamines generally offer alleviated phototoxicity and allow advanced video recording applications, including voltage imaging.

Abstract Extrachromosomal DNA (ecDNA), or double minute chromosomes, are established cytogenetic markers for malignancy and genome instability. More recently, the cancer community has gained a heightened awareness of the roles of ecDNA in cancer proliferation, drug resistance and epigenetic remodeling. A current hindrance to understanding the biological roles of ecDNA is the lack of available cell line model systems with experimental cytogenetic data that confirm ecDNA status. Although several recent landmark studies have identified common cell lines and tumor models with ecDNA, the current sample size limits our ability to detect ecDNA-driven molecular differences due to limitations in power. Increasing the number of model systems known to express ecDNA would provide new avenues for understanding the fundamental underpinnings of ecDNA biology and would unlock a wealth of potential targeting strategies for ecDNA-driven cancers. To bridge this gap, we created CytoCellDB, a resource that provides karyotype annotations and leverages publicly available global cell line data from the Cancer Dependency Map (DepMap) and the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE). Here, we identify 139 cell lines that express ecDNA, which is a 200% increase from the current sample size. We expanded the total number of cancer cell lines with ecDNA annotations to 577, which is a 400% increase or 31% of cell lines in CCLE/ DepMap. We demonstrate that a strength of CytoCellDB is the ability to interrogate ecDNA, and a compendium of other chromosomal aberrations, in the context of cancer-specific vulnerabilities, drug sensitivities, and molecular data (genomics, transcriptomics, methylation, proteomics). We anticipate that CytoCellDB will advance cytogenomics research and population-scale discoveries related to ecDNA as well as provide insights into strategies and best practices for determining novel therapeutics that overcome ecDNA-driven drug resistance.

Abstract Extrachromosomal DNA (ecDNA) are large (∼kilo to megabase) acentric, atelomeric, circular DNAs that are established cytogenetic markers for malignancy, hard-to-treat tumors and drug resistance. Often referred to as double minute chromosomes, ecDNA have been studied since the 1960s, primarily through molecular biology techniques, such as cytogenetics and fluorescence microscopy. More recently, next generation sequencing technologies present novel opportunities for identifying ecDNA. However, none of these approaches adequately address the architecture, size and composition of ecDNA within single cells. Developing an approach to systematically visualize ecDNA, confirm their circular architecture and determine their ultrastructure and composition is an urgent, unmet need. This work presents a protocol for visualizing ecDNA at high resolution using scanning electron microscopy (SEM). To this end, we have optimized an end-to-end procedure that involves preparing, processing and visualizing metaphase spread samples. This protocol was tested on five human cancer cell lines (COLO320DM, NCIH716, NCIH2170, SKGT2, SNU16), four of which express ecDNA in various amounts and one amplifies DNA via a homogeneous staining region (HSR). This work presents a standardized approach to preparing samples and visualizing ecDNA using SEM. Significance Extrachromosomal DNA (ecDNA) are proposed to have unique molecular traits, which include acentric, atelomeric and circular DNA. Standardized, high resolution microscopy approaches are in high demand to better understand structure-function relationships of ecDNA.