Abstract Desensitization is a common feature of ligand-gated ion channels although the molecular cause varies widely between channel types. Mutations that substantially reduce or abolish desensitization have been described for many ligand-gated ion channels including glutamate, GABA, glycine and nicotinic receptors but not for acid-sensing ion channels (ASICs) until recently. Mutating Gln276 to a glycine in human ASIC1a was reported to mostly abolish desensitization at both the macroscopic and single channel levels, potentially providing a valuable tool for subsequent studies. However, we find that in both human and chicken ASIC1 the effect of Q276G is modest. In chicken ASIC1, the equivalent Q277G slightly reduces desensitization when using pH 6.5 as a stimulus but desensitizes essentially like wild type when using more acidic pH values. In addition, steady-state desensitization is intact, albeit right-shifted, and recovery from desensitization is accelerated. Molecular dynamics simulations indicate that the Gln277 side chain participates in a hydrogen bond network that might stabilize the desensitized conformation. Consistent with this, destabilizing this network with the Q277N or Q277L mutations largely mimics the Q277G phenotype. In human ASIC1a, Q276G does not substantially reduce desensitization but surprisingly slows entry to and exit from the desensitized state, thus requiring longer agonist applications to reach equilibrium. Our data reveal that while the Q/G mutation does not substantially impair desensitization as previously reported, it does point to unexpected differences between chicken and human ASICs and the need for careful scrutiny before using this mutation in future studies.

Abstract The kainate receptors GluK1-3 belong to the family of ionotropic glutamate receptors and are essential for fast excitatory neurotransmission in the brain and associated with neurological and psychiatric diseases. How these receptors can be modulated by small molecule agents is not well-understood, especially for GluK3. We show that the positive allosteric modulator BPAM344 can be used to establish robust calcium-sensitive fluorescence-based assays at GluK1-3 for testing agonists, antagonists, and positive allosteric modulators. The EC 50 of BPAM344 for potentiating the response of 100 µM kainate was determined to 26.3 µM at GluK1, 75.4 µM at GluK2, and 639 µM at GluK3. In the presence of 150 µM BPAM344, domoate was found to be a potent agonist at GluK1 and GluK2 with EC 50 of 0.77 µM and 1.33 µM, respectively. At GluK3, domoate acts as a very weak agonist or antagonist with IC 50 of 14.5 µM, in the presence of 500 µM BPAM344 and 100 µM kainate. Using H523A mutated GluK3, we determined the first dimeric structure of the ligand-binding domain by X-ray crystallography, allowing location of BPAM344, zinc, sodium, and chloride ion binding sites at the dimer interface. Molecular dynamics simulations support the stability of the ion sites as well as the involvement of Asp761, Asp790, and Glu797 in binding of zinc ions. Using electron microscopy, we show that in the presence of glutamate and BPAM344, full-length GluK3 adopts a dimer-of-dimers arrangement. This study may contribute to unravelling the potential of kainate receptors as targets for treatment of brain diseases.

Acid-sensing ion channels (ASICs) are neuronal sodium-selective channels activated by reductions in extracellular pH. Structures of the three presumptive functional states, high-pH resting, low pH desensitized, and toxin-stabilized open, have all been solved for chicken ASIC1. These structures, along with prior functional data, suggest that the isomerization or flipping of the β11-12 linker in the extracellular, ligand-binding domain is an integral component of the desensitization process. To test this, we combined fast perfusion electrophysiology, molecular dynamics simulations and state-dependent non-canonical amino acid cross-linking. We find that both desensitization and recovery can be accelerated by orders of magnitude by mutating resides in this linker or the surrounding region. Furthermore, desensitization can be suppressed by trapping the linker in the resting state, indicating that isomerization of the β11-12 linker is not merely a consequence of, but a necessity for the desensitization process in ASICs

Abstract G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest family of signalling proteins responsible for translating extracellular stimuli into intracellular functions. When dysregulated, GPCRs drive numerous diseases and are the most targeted proteins in drug discovery. GPCR structural dynamics and activity can be modulated by a wide range of drugs, including full/partial agonists and antagonists. While crucial for developing novel therapeutics targeting GPCRs, the structural dynamics of the receptors associated with their activity upon drug interactions are not yet fully understood. Here, we employ Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS), to characterise the structural dynamics of turkey β1-adrenergic receptor (tβ1AR) in complex with nine ligands, including agonists, partial agonists and antagonists. We show that dynamic signatures across the GPCR structure can be grouped by compound modality. Surprisingly, we discovered repeated destabilisation of the intracellular loop 1 (ICL1) upon full agonist binding and stabilisation upon antagonist binding, suggesting that increased dynamics in this region are an essential component for G-protein recruitment. Multiple sequence alignments and molecular dynamics simulations indicate that L72 in ICL1 plays important structural role. Differential HDX-MS experiment of tβ1AR and tβ1AR L72A construct in complex with miniGs, in response to various ligands, suggests involvement of ICL1 in stabilising the GDP bound state by influencing the stability of HG helix of miniGs. Overall, our results provide a platform for determining drug modality and highlight how HDX-MS can be used to dissect receptor ligand interaction properties and GPCR mechanism. Significance statement Recent advances in hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry have allowed probing conformational signatures of challenging membrane protein assemblies. We studied the structural dynamics of a class A GPCR, namely tβ1AR, in response to diverse ligands including agonists, antagonists and partial agonists. We demonstrate that the functional effect of compounds can be discerned by simply profiling the dynamics induced across the receptor, without the need for downstream interaction partners. We showed that ICL1 undergoes a significant change in dynamics between activated and inhibited states consistent with a role in downstream signaling pathways in class A GPCRs.