Oligomerization of membrane proteins in response to lipid binding has a critical role in many cell-signalling pathways but is often difficult to define or predict. Here we report the development of a mass spectrometry platform to determine simultaneously the presence of interfacial lipids and oligomeric stability and to uncover how lipids act as key regulators of membrane-protein association. Evaluation of oligomeric strength for a dataset of 125 α-helical oligomeric membrane proteins reveals an absence of interfacial lipids in the mass spectra of 12 membrane proteins with high oligomeric stability. For the bacterial homologue of the eukaryotic biogenic transporters (LeuT, one of the proteins with the lowest oligomeric stability), we found a precise cohort of lipids within the dimer interface. Delipidation, mutation of lipid-binding sites or expression in cardiolipin-deficient Escherichia coli abrogated dimer formation. Molecular dynamics simulation revealed that cardiolipin acts as a bidentate ligand, bridging across subunits. Subsequently, we show that for the Vibrio splendidus sugar transporter SemiSWEET, another protein with low oligomeric stability, cardiolipin shifts the equilibrium from monomer to functional dimer. We hypothesized that lipids are essential for dimerization of the Na+/H+ antiporter NhaA from E. coli, which has the lowest oligomeric strength, but not for the substantially more stable homologous Thermus thermophilus protein NapA. We found that lipid binding is obligatory for dimerization of NhaA, whereas NapA has adapted to form an interface that is stable without lipids. Overall, by correlating interfacial strength with the presence of interfacial lipids, we provide a rationale for understanding the role of lipids in both transient and stable interactions within a range of α-helical membrane proteins, including G-protein-coupled receptors.

Mass spectrometry (MS) of intact soluble protein complexes has emerged as a powerful technique to study the stoichiometry, structure-function and dynamics of protein assemblies. Recent developments have extended this technique to the study of membrane protein complexes, where it has already revealed subunit stoichiometries and specific phospholipid interactions. Here we describe a protocol for MS of membrane protein complexes. The protocol begins with the preparation of the membrane protein complex, enabling not only the direct assessment of stoichiometry, delipidation and quality of the target complex but also the evaluation of the purification strategy. A detailed list of compatible nonionic detergents is included, along with a protocol for screening detergents to find an optimal one for MS, biochemical and structural studies. This protocol also covers the preparation of lipids for protein-lipid binding studies and includes detailed settings for a quadrupole time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer after the introduction of complexes from gold-coated nanoflow capillaries.

Abstract There is increasing evidence that some proteins fold during translation, i.e. cotranslationally, which implies that partial protein function, including interactions with other molecules, could potentially be unleashed early on during translation. Although little is known about cotranslational assembly mechanisms, for homomeric protein complexes, translation by the ribosome, folding and assembly, should be well-coordinated to avoid misassembly in the context of polysomes. We analysed 3D structures of homomers and identified a statistically significant trend conserved across evolution that supports this hypothesis: namely that homomeric contacts tend to be localized towards the C-terminus rather than N-terminus of homomeric polypeptide chains. To probe this in more detail, we expressed a GFP-based library of 611 homomeric E. coli genes, and analyzing their folding and assembly in vivo . Consistent with our hypothesis, interface residues tend to be located near the N-terminus in cotranslationally aggregating homomers. In order to dissect the mechanisms of folding and assembly under controlled conditions, we engineered a protein library with three variable components: (i) the position and type homomerization domain, (ii) the reporter domain and (iii) the linker length that connects the two. By analyzing the misassembly rates of these engineered constructs in vivo , in vitro and in silico , we confirmed our hypothesis that C-terminal homomerization is favorable to N-terminal homomerization. More generally, these results provide a set of spatiotemporal constraints within polypeptide chains that favor efficient assembly, with implications for protein evolution and design.

Native mass spectrometry (MS) is proving to be a disruptive technique for studying the interactions of proteins, necessary for understanding the functional roles of these biomolecules. Recent research is expanding the application of native MS towards membrane proteins directly from isolated membrane preparations or from purified detergent micelles. The former results in complex spectra comprising several heterogeneous protein complexes; the latter enables therapeutic protein targets to be screened against multiplexed preparations of compound libraries. In both cases, the resulting spectra are increasingly complex to assign/interpret, and the key to these new directions of native MS research is the ability to perform native top-down analysis, which allows unambiguous peak assignment. To achieve this, detergent removal is necessary prior to MS analyzers, which allow selection of specific m/z values, representing the parent ion for downstream activation. Here, we describe a novel, enhanced declustering (ED) device installed into the first pumping region of a cyclic IMS-enabled mass spectrometry platform. The device enables declustering of ions prior to the quadrupole by imparting collisional activation through an oscillating electric field applied between two parallel plates. The positioning of the device enables liberation of membrane protein ions from detergent micelles. Quadrupole selection can now be utilized to isolate protein–ligand complexes, and downstream collision cells enable the dissociation and identification of binding partners. We demonstrate that ion mobility (IM) significantly aids in the assignment of top-down spectra, aligning fragments to their corresponding parent ions by means of IM drift time. Using this approach, we were able to confidently assign and identify a novel hit compound against PfMATE, obtained from multiplexed ligand libraries.

ABSTRACT Colicins are protein antibiotics used by bacteria to eliminate competing Escherichia coli. Colicins frequently exploit outer membrane (OM) nutrient transporters to penetrate through the strictly impermeable bacterial cellular envelope. Here, applying live-cell fluorescence imaging we were able to follow colicin B (ColB) into E. coli and localize it within the periplasm. We further demonstrate that single-stranded DNA coupled to ColB is also transported into the periplasm, emphasizing that the import routes of colicins can be exploited to carry large cargo molecules into bacteria. Moreover, we characterize the molecular mechanism of ColB association with its OM receptor FepA, applying a combination of photo-activated crosslinking, mass spectrometry, and structural modeling. We demonstrate that complex formation is coincident with a large-scale conformational change in the colicin. Finally In vivo crosslinking experiments and supplementary simulations of the translocation process indicate that part of the colicin engages active transport by disguising itself to part of the cellular receptor.

Abstract G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) constitute the largest family of signalling proteins responsible for translating extracellular stimuli into intracellular functions. When dysregulated, GPCRs drive numerous diseases and are the most targeted proteins in drug discovery. GPCR structural dynamics and activity can be modulated by a wide range of drugs, including full/partial agonists and antagonists. While crucial for developing novel therapeutics targeting GPCRs, the structural dynamics of the receptors associated with their activity upon drug interactions are not yet fully understood. Here, we employ Hydrogen Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS), to characterise the structural dynamics of turkey β1-adrenergic receptor (tβ1AR) in complex with nine ligands, including agonists, partial agonists and antagonists. We show that dynamic signatures across the GPCR structure can be grouped by compound modality. Surprisingly, we discovered repeated destabilisation of the intracellular loop 1 (ICL1) upon full agonist binding and stabilisation upon antagonist binding, suggesting that increased dynamics in this region are an essential component for G-protein recruitment. Multiple sequence alignments and molecular dynamics simulations indicate that L72 in ICL1 plays important structural role. Differential HDX-MS experiment of tβ1AR and tβ1AR L72A construct in complex with miniGs, in response to various ligands, suggests involvement of ICL1 in stabilising the GDP bound state by influencing the stability of HG helix of miniGs. Overall, our results provide a platform for determining drug modality and highlight how HDX-MS can be used to dissect receptor ligand interaction properties and GPCR mechanism. Significance statement Recent advances in hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry have allowed probing conformational signatures of challenging membrane protein assemblies. We studied the structural dynamics of a class A GPCR, namely tβ1AR, in response to diverse ligands including agonists, antagonists and partial agonists. We demonstrate that the functional effect of compounds can be discerned by simply profiling the dynamics induced across the receptor, without the need for downstream interaction partners. We showed that ICL1 undergoes a significant change in dynamics between activated and inhibited states consistent with a role in downstream signaling pathways in class A GPCRs.