Abstract Hydrogel biomaterials have proven indispensable for three-dimensional (3D) cell culture but have fallen short in replicating the innate physiochemical complexity of real tissue. Though traditional photolithography affords localized material manipulation, robust methods that govern when, where, and to what extent such phototailoring occurs throughout materials would be profoundly enabling towards fabricating more-realistic 3D tissue constructs. Here, we introduce “grayscale image z-stack-guided multiphoton optical-lithography” (GIZMO) as a generalizable and intuitive strategy to rapidly photomodulate materials in full 3D non-binary patterns at submicron resolutions spanning large volumes (>mm 3 ). Highlighting its versatility, we employ GIZMO to variably photopattern biomolecule release from, protein immobilization to, and degradation within hydrogels based on biologically derived or synthetic grayscale image stacks with unprecedented complexity. We anticipate that GIZMO will enable new opportunities to probe and manipulate cell fates, as well as to engineer complex functional tissue.

Abstract Slide-free digital pathology techniques, including nondestructive 3D microscopy, are gaining interest as alternatives to traditional slide-based histology. In order to facilitate clinical adoption of these fluorescence-based techniques, software methods have been developed to convert grayscale fluorescence images into color images that mimic the appearance of standard absorptive chromogens such as hematoxylin and eosin (H&E). However, these false-coloring algorithms often require manual and iterative adjustment of parameters, with results that can be inconsistent in the presence of intensity nonuniformities within an image and/or between specimens (intra- and inter-specimen variability). Here, we present an open-source (Python-based) rapid intensity-leveling and digital-staining package that is specifically designed to render two-channel fluorescence images (i.e. a fluorescent analog of H&E) to the traditional H&E color space for 2D and 3D microscopy datasets. However, this method can be easily tailored for other false-coloring needs. Our package offers (1) automated and uniform false coloring in spite of uneven staining within a large thick specimen, (2) consistent color-space representations that are robust to variations in staining and imaging conditions between different specimens, and (3) GPU-accelerated data processing to allow these methods to scale to large datasets. We demonstrate this platform by generating H&E-like images from cleared tissues that are fluorescently imaged in 3D with open-top light-sheet (OTLS) microscopy, and quantitatively characterizing the results in comparison to traditional slide-based H&E histology.

We implement a 3D segmentation workflow on volumetric prostate cancer datasets that involves training a deep learning model to generate synthetic immunofluorescence images highlighting vessels or nerves. The 3D analysis of prostate cancer cells in relation to vessels and nerves is being explored for patient risk assessment.

Recent advances in optical clearing and light-sheet microscopy have provided unprecedented access to structural and molecular information from intact tissues. However, current light-sheet microscopes have imposed constraints on the size, shape, number of specimens, and compatibility with various clearing protocols. Here we present a multi-immersion open-top light-sheet microscope that enables simple mounting of multiple specimens processed with a variety of protocols, which will facilitate wider adoption by preclinical researchers and clinical laboratories.