Tissues with perfusable vascular networks can be fabricated through layer-by-layer assembly, bioprinting or sacrificial moulding, but current approaches are slow, have limited resolution, or place significant constraints on the materials or the processing conditions. A rapid and general vascular casting approach using carbohydrate glass as a sacrificial template to generate tissues containing cylindrical networks that can be lined with endothelial cells and perfused with blood under high-pressure pulsatile flow is now reported. In the absence of perfusable vascular networks, three-dimensional (3D) engineered tissues densely populated with cells quickly develop a necrotic core1. Yet the lack of a general approach to rapidly construct such networks remains a major challenge for 3D tissue culture2,3,4. Here, we printed rigid 3D filament networks of carbohydrate glass, and used them as a cytocompatible sacrificial template in engineered tissues containing living cells to generate cylindrical networks that could be lined with endothelial cells and perfused with blood under high-pressure pulsatile flow. Because this simple vascular casting approach allows independent control of network geometry, endothelialization and extravascular tissue, it is compatible with a wide variety of cell types, synthetic and natural extracellular matrices, and crosslinking strategies. We also demonstrated that the perfused vascular channels sustained the metabolic function of primary rat hepatocytes in engineered tissue constructs that otherwise exhibited suppressed function in their core.

Routes to independent vessel networks In air-breathing vertebrates, the circulatory and pulmonary systems contain separate networks of channels that intertwine but do not intersect with each other. Recreating such structures within cell-compatible materials has been a major challenge; even a single vasculature system can be a burden to create. Grigoryan et al. show that natural and synthetic food dyes can be used as photoabsorbers that enable stereolithographic production of hydrogels containing intricate and functional vascular architectures. Using this approach, they demonstrate functional vascular topologies for studies of fluid mixers, valves, intervascular transport, nutrient delivery, and host engraftment. Science , this issue p. 458

Success of human myocardial tissue engineering for cardiac repair has been limited by adverse effects of scaffold materials, necrosis at the tissue core, and poor survival after transplantation due to ischemic injury. Here, we report the development of scaffold-free prevascularized human heart tissue that survives in vivo transplantation and integrates with the host coronary circulation. Human embryonic stem cells (hESCs) were differentiated to cardiomyocytes by using activin A and BMP-4 and then placed into suspension on a rotating orbital shaker to create human cardiac tissue patches. Optimization of patch culture medium significantly increased cardiomyocyte viability in patch centers. These patches, composed only of enriched cardiomyocytes, did not survive to form significant grafts after implantation in vivo. To test the hypothesis that ischemic injury after transplantation would be attenuated by accelerated angiogenesis, we created "second-generation," prevascularized, and entirely human patches from cardiomyocytes, endothelial cells (both human umbilical vein and hESC-derived endothelial cells), and fibroblasts. Functionally, vascularized patches actively contracted, could be electrically paced, and exhibited passive mechanics more similar to myocardium than patches comprising only cardiomyocytes. Implantation of these patches resulted in 10-fold larger cell grafts compared with patches composed only of cardiomyocytes. Moreover, the preformed human microvessels anastomosed with the rat host coronary circulation and delivered blood to the grafts. Thus, inclusion of vascular and stromal elements enhanced the in vitro performance of engineered human myocardium and markedly improved viability after transplantation. These studies demonstrate the importance of including vascular and stromal elements when designing human tissues for regenerative therapies.

Tissue vascularization and integration with host circulation remains a key barrier to the translation of engineered tissues into clinically relevant therapies. Here, we used a microtissue molding approach to demonstrate that constructs containing highly aligned “cords” of endothelial cells triggered the formation of new capillaries along the length of the patterned cords. These vessels became perfused with host blood as early as 3 d post implantation and became progressively more mature through 28 d. Immunohistochemical analysis showed that the neovessels were composed of human and mouse endothelial cells and exhibited a mature phenotype, as indicated by the presence of alpha-smooth muscle actin–positive pericytes. Implantation of cords with a prescribed geometry demonstrated that they provided a template that defined the neovascular architecture in vivo. To explore the utility of this geometric control, we implanted primary rat and human hepatocyte constructs containing randomly organized endothelial networks vs. ordered cords. We found substantially enhanced hepatic survival and function in the constructs containing ordered cords following transplantation in mice. These findings demonstrate the importance of multicellular architecture in tissue integration and function, and our approach provides a unique strategy to engineer vascular architecture.

The liver has been studied extensively due to the broad number of diseases affecting its vital functions. However, therapeutic advances, especially in regenerative medicine, are currently hampered by the lack of knowledge concerning human hepatic cell development. Here, we addressed this limitation by describing the developmental trajectories of different cell types comprising the human fetal liver at single-cell resolution. These transcriptomic analyses revealed that sequential cell-to-cell interactions direct functional maturation of hepatocytes, with non-parenchymal cells playing critical, supportive roles during organogenesis. We utilised this information to derive bipotential hepatoblast organoids and then exploited this novel model system to validate the importance of key signalling pathways and developmental cues. Furthermore, these insights into hepatic maturation enabled the identification of stage-specific transcription factors to improve the functionality of hepatocyte-like cells generated from human pluripotent stem cells. Thus, our study establishes a new platform to investigate the basic mechanisms of human liver development and to produce cell types for clinical applications.

Abstract Hydrogel biomaterials have proven indispensable for three-dimensional (3D) cell culture but have fallen short in replicating the innate physiochemical complexity of real tissue. Though traditional photolithography affords localized material manipulation, robust methods that govern when, where, and to what extent such phototailoring occurs throughout materials would be profoundly enabling towards fabricating more-realistic 3D tissue constructs. Here, we introduce “grayscale image z-stack-guided multiphoton optical-lithography” (GIZMO) as a generalizable and intuitive strategy to rapidly photomodulate materials in full 3D non-binary patterns at submicron resolutions spanning large volumes (>mm 3 ). Highlighting its versatility, we employ GIZMO to variably photopattern biomolecule release from, protein immobilization to, and degradation within hydrogels based on biologically derived or synthetic grayscale image stacks with unprecedented complexity. We anticipate that GIZMO will enable new opportunities to probe and manipulate cell fates, as well as to engineer complex functional tissue.

Recent single cell analyses have found molecular heterogeneities within populations of pluripotent stem cells (PSCs). A tool that tracks single cell lineages and their phenotypes longitudinally would reveal whether heterogeneity extends beyond molecular identity. Hence, we generated a stable Cre-inducible rainbow reporter human PSC line that provides up to 18 unique membrane-targeted fluorescent barcodes. These barcodes enable repeated assessments of single cells as they clonally expand, change morphology, and migrate. Owing to the cellular resolution of this reporter, we identified subsets of PSCs with enhanced clonal expansion, synchronized cell divisions, and persistent localization to colony edges. Reporter expression was stably maintained throughout directed differentiation into cardiac myocytes, cortical neurons, and hepatoblasts. Repeated examination of neural differentiation revealed self-assembled cortical tissues derive from clonally dominant progenitors. Collectively, these findings demonstrate the broad utility and easy implementation of this reporter line for tracking single cell behavior.

Abstract Liver disease affects millions globally and end-stage liver failure is only cured by organ transplant. Unfortunately, there is a growing shortage of donor organs and disparities in equitable access to transplants among different populations. Less than 10% of global transplantation needs are currently met, highlighting the demand for alternative therapies. Engineered liver tissue grafts that supplement organ function could address these demands. While engineered liver tissues built from human hepatocytes, endothelial cells, and fibroblasts encased in hydrogel have been successfully engrafted in rodent models previously, the extent to which these tissues express human liver metabolic genes and proteins remains unknown. Here, we built engineered human liver tissues and characterized their engraftment, expansion, and metabolic phenotype at sequential stages post-implantation by RNA sequencing, histology, and host serology. Expression of metabolic genes was observed at weeks 1-2, followed by cellular organization into hepatic cords by weeks 4-9.5. Furthermore, grafted engineered tissues exhibited progressive spatially restricted expression of critical functional proteins known to be zonated in the native human liver. To our knowledge, this is the first report of engineered human liver tissue zonation after implantation in vivo, which could have important translational implications for this field.

Material- and cell-based technologies such as engineered tissues hold great promise as human therapies. Yet, the development of many of these technologies becomes stalled at the stage of pre-clinical animal studies due to the tedious and low-throughput nature of in vivo implantation experiments. We introduce a 'plug and play' in vivo screening array platform called Highly Parallel Tissue Grafting (HPTG). HPTG enables parallelized in vivo screening of 43 three-dimensional microtissues within a single 3D printed device. Using HPTG, we screen microtissue formations with varying cellular and material components and identify formulations that support vascular self-assembly, integration and tissue function. Our studies highlight the importance of combinatorial studies that vary cellular and material formulation variables concomitantly, by revealing that inclusion of stromal cells can "rescue" vascular self-assembly in manner that is material-dependent. HPTG provides a route for accelerating pre-clinical progress for diverse medical applications including tissue therapy, cancer biomedicine, and regenerative medicine.

Advanced ScienceVolume 11, Issue 24 2470144 Back CoverOpen Access Genetically Encoded XTEN-based Hydrogels with Tunable Viscoelasticity and Biodegradability for Injectable Cell Therapies (Adv. Sci. 24/2024) Jennifer I. Bennett, Jennifer I. BennettSearch for more papers by this authorMary O'Kelly Boit, Mary O'Kelly BoitSearch for more papers by this authorNicole E. Gregorio, Nicole E. GregorioSearch for more papers by this authorFan Zhang, Fan ZhangSearch for more papers by this authorRyan D. Kibler, Ryan D. KiblerSearch for more papers by this authorJack W. Hoye, Jack W. HoyeSearch for more papers by this authorOlivia Prado, Olivia PradoSearch for more papers by this authorPeter B. Rapp, Peter B. RappSearch for more papers by this authorCharles E. Murry, Charles E. MurrySearch for more papers by this authorKelly R. Stevens, Kelly R. StevensSearch for more papers by this authorCole A. DeForest, Cole A. DeForestSearch for more papers by this author Jennifer I. Bennett, Jennifer I. BennettSearch for more papers by this authorMary O'Kelly Boit, Mary O'Kelly BoitSearch for more papers by this authorNicole E. Gregorio, Nicole E. GregorioSearch for more papers by this authorFan Zhang, Fan ZhangSearch for more papers by this authorRyan D. Kibler, Ryan D. KiblerSearch for more papers by this authorJack W. Hoye, Jack W. HoyeSearch for more papers by this authorOlivia Prado, Olivia PradoSearch for more papers by this authorPeter B. Rapp, Peter B. RappSearch for more papers by this authorCharles E. Murry, Charles E. MurrySearch for more papers by this authorKelly R. Stevens, Kelly R. StevensSearch for more papers by this authorCole A. DeForest, Cole A. DeForestSearch for more papers by this author First published: 26 June 2024 https://doi.org/10.1002/advs.202470144AboutPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onEmailFacebookTwitterLinkedInRedditWechat Graphical Abstract Injectable Cell Therapies Single-component protein hydrogels assembled through homopentameric coiled-coil bundling exhibit rapid shear thinning and self-healing, protecting and sustaining viability of encapsulated cells through culture, injection, and transcutaneous implantation. More details can be found in article number 2301708 by Cole A. DeForest and co-workers. Volume11, Issue24June 26, 20242470144 RelatedInformation