Developing methods for investigating coupled enzyme systems under conditions that mimic the cellular environment remains a significant challenge. Here we describe a biomimetic approach for constructing densely packed and confined multienzyme systems through the co-encapsulation of 2 and 3 enzymes within a virus-like particle (VLP) that perform a coupled cascade of reactions, creating a synthetic metabolon. Enzymes are efficiently encapsulated in vivo with known stoichiometries, and the kinetic parameters of the individual and coupled activities are characterized. From the results we develop and validate a mathematical model for predicting the expected kinetics for coupled reactions under co-localized conditions.

Abstract Computational tools addressing various components of design-build-test-learn loops (DBTL) for the construction of synthetic genetic networks exist, but do not generally cover the entire DBTL loop. This manuscript introduces an end-to-end sequence of tools that together form a DBTL loop called DART (Design Assemble Round Trip). DART provides rational selection and refinement of genetic parts to construct and test a circuit. Computational support for experimental process, metadata management, standardized data collection, and reproducible data analysis is provided via the previously published Round Trip (RT) test-learn loop. The primary focus of this work is on the Design Assemble (DA) part of the tool chain, which improves on previous techniques by screening up to thousands of network topologies for robust performance using a novel robustness score derived from dynamical behavior based on circuit topology only. In addition, novel experimental support software is introduced for the assembly of genetic circuits. A complete design-through-analysis sequence is presented using several OR and NOR circuit designs, with and without structural redundancy, that are implemented in budding yeast. The execution of DART tested the predictions of the design tools, specifically with regard to robust and reproducible performance under different experimental conditions. The data analysis depended on a novel application of machine learning techniques to segment bimodal flow cytometry distributions. Evidence is presented that, in some cases, a more complex build may impart more robustness and reproducibility across experimental conditions.

Abstract A challenge in the design and construction of synthetic genetic circuits is that they will operate within biological systems that have noisy and changing parameter regimes that are largely unmeasurable. The outcome is that these circuits do not operate within design specifications or have a narrow operational envelope in which they can function. This behavior is often observed as a lack of reproducibility in function from day to day or lab to lab. Moreover, this narrow range of operating conditions does not promote reproducible circuit function in deployments where environmental conditions for the chassis are changing, as environmental changes can affect the parameter space in which the circuit is operating. Here we describe a computational method for assessing the robustness of circuit function across broad parameter regions. Previously designed circuits are assessed by this computational method and then circuit performance is measured across multiple growth conditions in budding yeast. The computational predictions are correlated with experimental findings, suggesting that the approach has predictive value for assessing the robustness of a circuit design.

ABSTRACT Fitness benefits from division of labor in microbial consortia are well documented, but the dependency of the benefits on environmental context is poorly understood. Two synthetic Escherichia coli consortia were built to test the relationships between exchanged organic acid, local environment, and opportunity costs of different metabolic strategies. Opportunity costs quantify benefits not realized due to selecting one phenotype over another. The consortia catabolized glucose and exchanged either acetic or lactic acid to create producer-consumer food webs. The organic acids had different inhibitory properties and different opportunity costs associated with their positions in central metabolism. The exchanged metabolites modulated different consortial dynamics. The acetic acid-exchanging (AAE) consortium had a ‘push’ interaction motif where acetic acid was secreted faster by the producer than the consumer imported it, while the lactic acid-exchanging (LAE) consortium had a ‘pull’ interaction motif where the consumer imported lactic acid at a comparable rate to its production. The LAE consortium outperformed wild type (WT) batch cultures under the environmental context of weakly buffered conditions, achieving a 55% increase in biomass titer, a 51% increase in biomass per proton yield, an 86% increase in substrate conversion, and the complete elimination of byproduct accumulation all relative to the WT. However, the LAE consortium had the tradeoff of a 42% lower specific growth rate. The AAE consortium did not outperform the WT in any considered fitness metric. Fitness advantages of the LAE consortium were sensitive to environment; increasing the medium buffering capacity negated the fitness advantages compared to WT. IMPORTANCE Most naturally occurring microorganisms persist in consortia where metabolic interactions are common and often essential to ecosystem function. This study uses synthetic ecology to test how different cellular interaction motifs influence fitness properties of consortia. Environmental context ultimately controlled the division of labor fitness as shifts from weakly buffered to highly buffered conditions negated the benefits of the strategy. Understanding the limits of division of labor advances our understanding of natural community functioning which is central to nutrient cycling and provides design rules for assembling consortia used in applied bioprocessing.

Abstract Although mutualisms are often studied as simple pairwise interactions, they typically involve complex networks of interacting species. How multiple mutualistic partners that provide the same service and compete for resources are maintained in mutualistic networks is an open question. We use a model bacterial community in which multiple ‘partner strains’ of Escherichia coli compete for a carbon source and exchange resources with a ‘shared mutualist’ strain of Salmonella enterica . In laboratory experiments, competing E. coli strains readily coexist in the presence of S. enterica , despite differences in their competitive abilities. We use ecological modeling to demonstrate that a shared mutualist can create temporary resource niche differentiation by limiting growth rates, even if yield is set by a resource external to a mutualism. This mechanism can extend to maintain multiple competing partner species. Our results improve our understanding of complex mutualistic communities and aid efforts to design stable microbial communities.

Abstract Large programs of dynamic gene expression, like cell cyles and circadian rhythms, are controlled by a relatively small “core” network of transcription factors and post-translational modifiers, working in concerted mutual regulation. Recent work suggests that system-independent, quantitative features of the dynamics of gene expression can be used to identify core regulators. We introduce an approach of iterative network hypothesis reduction from time-series data in which increasingly complex features of the dynamic expression of individual, pairs, and entire collections of genes are used to infer functional network models that can produce the observed transcriptional program. The culmination of our work is a computational pipeline, I terative N etwork H ypoth e sis Re ductio n from T emporal Dynamics (Inherent Dynamics Pipeline), that provides a priority listing of targets for genetic perturbation to experimentally infer network structure. We demonstrate the capability of this integrated computational pipeline on synthetic and yeast cell-cycle data. Author Summary In this work we discuss a method for identifying promising experimental targets for genetic network inference by leveraging different features of time series gene expression data along a chained set of previously published software tools. We aim to locate small networks that control oscillations in the genome-wide expression profile in biological functions such as the circadian rhythm and the cell cycle. We infer the most promising targets for further experimentation, emphasizing that modeling and experimentation are an ∗ Corresponding author: breschine.cummins@montana.edu essential feedback loop for confident predictions of core network structure. Our major offering is the reduction of experimental time and expense by providing targeted guidance from computational methods for the inference of oscillating core networks, particularly in novel organisms.

Abstract Mathematical modeling of the emergent dynamics of gene regulatory networks (GRN) faces a double challenge of (a) dependence of model dynamics on parameters, and (b) lack of reliable experimentally determined parameters. In this paper we compare two complementary approaches for describing GRN dynamics across unknown parameters: (1) parameter sampling and resulting ensemble statistics used by RACIPE (RAndom CIrcuit PErturbation), and (2) use of rigorous analysis of combinatorial approximation of the ODE models by DSGRN (Dynamic Signatures Generated by Regulatory Networks). We find a very good agreement between RACIPE simulation and DSGRN predictions for four different 2- and 3-node networks typically observed in cellular decision making. This observation is remarkable since the DSGRN approach assumes that the Hill coefficients of the models are very high while RACIPE assumes the values in the range 1-6. Thus DSGRN parameter domains, explicitly defined by inequalities between systems parameters, are highly predictive of ODE model dynamics within a biologically reasonable range of parameters.

Abstract Different strains of a microorganism growing in the same environment display a wide variety of growth rates and growth yields. We developed a coarse-grained model to test the hypothesis that different resource allocation strategies, corresponding to different compositions of the proteome, can account for the observed rate-yield variability. The model predictions were verified by means of a database of hundreds of published rate-yield and uptake-secretion phenotypes of Escherichia coli strains grown in standard laboratory conditions. We found a very good quantitative agreement between the range of predicted and observed growth rates, growth yields, and glucose uptake and acetate secretion rates. These results support the hypothesis that resource allocation is a major explanatory factor of the observed variability of growth rates and growth yields across different bacterial strains. An interesting prediction of our model, supported by the experimental data, is that high growth rates are not necessarily accompanied by low growth yields. The resource allocation strategies enabling high-rate, high-yield growth of E. coli lead to a higher saturation of enzymes and ribosomes, and thus to a more efficient utilization of proteomic resources. Our model thus contributes to a fundamental understanding of the quantitative relationship between rate and yield in E. coli and other microorganisms. It may also be useful for the rapid screening of strains in metabolic engineering and synthetic biology.

This study addresses a problem of correspondence between dynamics of a parameterized system and the structure of interactions within that system. The structure of interactions is captured by a signed network. A network dynamics is parameterized by collections of multi-level monotone Boolean functions (MBFs), which are organized in a parameter graph PG . Each collection generates dynamics which are captured in a structure of recurrent sets called a Morse graph. We study two operations on signed graphs, switching and subnetwork inclusion, and show that these induce dynamics-preserving maps between parameter graphs. We show that duality, a standard operation on MBFs, and switching are dynamically related: If M is the switch of N , then duality gives an isomorphism between PG ( N ) and PG ( M ) which preserves dynamics and thus Morse graphs. We then show that for each subnetwork M ⊂ N , there are embeddings of the parameter graph PG ( M ) into PG ( N ) that preserve the Morse graph. Since our combinatorial description of network dynamics is closely related to switching ODE network models, our results suggest similar results for parameterized sets of smooth ODE network models of the network dynamics.

Abstract Elucidating the emergent dynamics of complex regulatory networks enabling cellular differentiation is crucial to understand embryonic development and suggest strategies for synthetic circuit design. A well-studied network motif often driving cellular decisions is a toggle switch - a set of two mutually inhibitory lineage-specific transcription factors A and B. A toggle switch often enables two possible mutually exclusive states - (high A, low B) and (low A, high B) - from a common progenitor cell. However, the dynamics of networks enabling differentiation of more than two cell types from a progenitor cell is not well-studied. Here, we investigate the dynamics of four master regulators A, B, C and D inhibiting each other, thus forming a toggle tetrahedron. Our simulations show that a toggle tetrahedron predominantly allows for co-existence of six ‘double positive’ or hybrid states where two of the nodes are expressed relatively high as compared to the remaining two - (high A, high B, low C, low D), (high A, low B, high C, low D), (high A, low B, low C, high D), (low A, high B, high C, low D), (low A, low B, high C, high D) and (low A, high B, low C, high D). Stochastic simulations showed state-switching among these phenotypes, indicating phenotypic plasticity. Finally, we apply our results to understand the differentiation of naive CD4 + T cells into Th1, Th2, Th17 and Treg subsets, suggesting Th1/Th2/Th17/Treg decision-making to be a two-step process. Our results reveal multistable dynamics and establish the stable co-existence of hybrid cell-states, offering a potential explanation for simultaneous differentiation of multipotent naïve CD4+ T cells.