Abstract The identification of chromosome number alterations is now widespread in cancer research, but three features of genomic data hinder copy number calling and downstream analyses: the purity of the tumour sample, intra-tumour heterogeneity, and the ploidy of the tumour. To assess these features, consensus methods are often utilised, though these become onerous in projects that involve thousands of genomes. To facilitate the validation of clonal and subclonal copy number variants we present CNAqc, an evolution-inspired toolset that leverages the known quantitative relationships of purity, ploidy and heterogeneity. We validate the algorithms in CNAqc using low-pass single-cell data, as well as extensive simulations. Its application is demonstrated using over 4000 whole genomes and exomes from TCGA, and PCAWG. A real world application of CNAqc in the analysis of clinical tumour samples, has been demonstrated by its incorporation into the validation of clinically accredited bioinformatics pipeline at Genomics England. Our approach is compatible with most bioinformatic pipelines and designed to augment algorithms with automated quality control procedures for data validation.

ABSTRACT To characterise the somatic alterations in colorectal cancer (CRC), we conducted whole-genome sequencing analysis of 2,023 tumours. We provide the most detailed high-resolution map to date of somatic mutations in CRC, and demonstrate associations with clinicopathological features, in particular location in the large bowel. We refined the mutational processes and signatures acting in colorectal tumorigenesis. In analyses across the sample set or restricted to molecular subtypes, we identified 185 CRC driver genes, of which 117 were previously unreported. New drivers acted in various molecular pathways, including Wnt ( CTNND1, AXIN1, TCF3 ), TGF-β/BMP ( TGFBR1 ) and MAP kinase ( RASGRF1, RASA1, RAF1 , and several MAP2K and MAP3K loc i ). Non-coding drivers included intronic neo-splice site alterations in APC and SMAD4 . Whilst there was evidence of an excess of mutations in functionally active regions of the non-coding genome, no specific drivers were called with high confidence. Novel recurrent copy number changes included deletions of PIK3R1 and PWRN1 , as well as amplification of CCND3 and NEDD9 . Putative driver structural variants included BRD4 and SOX9 regulatory elements, and ACVR2A and ANKRD11 hotspot deletions. The frequencies of many driver mutations, including somatic Wnt and Ras pathway variants, showed a gradient along the colorectum. The Pks-pathogenic E. coli signature and TP53 mutations were primarily associated with rectal cancer. A set of unreported immune escape driver genes was found, primarily in hypermutated CRCs, most of which showed evidence of genetic evasion of the anti-cancer immune response. About 25% of cancers had a potentially actionable mutation for a known therapy. Thirty-three of the new driver genes were predicted to be essential, 17 possessed a druggable structure, and nine had a bioactive compound available. Our findings provide further insight into the genetics and biology of CRC, especially tumour subtypes defined by genomic instability or clinicopathological features.

Abstract Cancer evolution is driven by natural selection acting upon phenotypic trait variation. However, the extent to which phenotypic variation within a tumour is a consequence of intra-tumour genetic heterogeneity remains undetermined. Here we show that colorectal cancer cells frequently have highly plastic phenotypic traits in vivo in patient tumours. We measured the degree to which trait variation reflects genetic ancestry by quantifying the phylogenetic signal of gene expression across 297 samples with multi-region paired whole genome and transcriptome sequencing collected from 27 primary colorectal cancers. Within-tumour phylogenetic signal for genes and pathways was detected only infrequently, suggesting that the majority of intra-tumour variation in gene expression programmes was not strongly heritable. Expression quantitative trait loci analyses (eQTL) identified a small number of putative mechanisms of genetic control of gene expression due to the cis -acting coding, non-coding and structural genetic alteration, but most gene expression variation was not explained by our genetic analysis. Leveraging matched chromatin-accessibility sequencing data, enhancer mutations with cis regulatory effects on gene expression were associated with a change in chromatin accessibility, indicating that non-coding variation can have phenotypic consequence through modulation of the 3D architecture of the genome. This study maps the evolution of transcriptional variation during cancer evolution, highlighting that intra-tumour phenotypic plasticity is pervasive in colorectal malignancies, and may play key roles in further tumour evolution, from metastasis to therapy resistance.

Abstract Colorectal carcinoma (CRC) is a common cause of mortality 1 , but a comprehensive description of its genomic landscape is lacking 2–9 . Here we perform whole-genome sequencing of 2,023 CRC samples from participants in the UK 100,000 Genomes Project, thereby providing a highly detailed somatic mutational landscape of this cancer. Integrated analyses identify more than 250 putative CRC driver genes, many not previously implicated in CRC or other cancers, including several recurrent changes outside the coding genome. We extend the molecular pathways involved in CRC development, define four new common subgroups of microsatellite-stable CRC based on genomic features and show that these groups have independent prognostic associations. We also characterize several rare molecular CRC subgroups, some with potential clinical relevance, including cancers with both microsatellite and chromosomal instability. We demonstrate a spectrum of mutational profiles across the colorectum, which reflect aetiological differences. These include the role of Escherichia coli pks+ colibactin in rectal cancers 10 and the importance of the SBS93 signature 11–13 , which suggests that diet or smoking is a risk factor. Immune-escape driver mutations 14 are near-ubiquitous in hypermutant tumours and occur in about half of microsatellite-stable CRCs, often in the form of HLA copy number changes. Many driver mutations are actionable, including those associated with rare subgroups (for example, BRCA1 and IDH1 ), highlighting the role of whole-genome sequencing in optimizing patient care.

Abstract Somatic driver mutations, in genes such as FBXW7, have been discovered in phenotypically normal colonic tissue, however their role in cancer initiation remains elusive. Here, using patient-derived human colon organoids as models of early tumour evolution we investigate the consequences of FBXW7 mutations in normal and gene-edited organoids. We observed that FBXW7 mutations exert an epistatic effect where the transcriptional consequences of the mutation are dependent on the background mutational makeup of the cell. Specifically, we found the timing of acquiring an FBXW7 mutation relative to APC mutation, led to profound differences. When FBXW7 was mutated before APC , repression of the APC transcriptional response and maintenance of near-normal cell state was seen. However, when APC was mutated before FBXW7 , cells acquired classic cancer-stem cell features. Single-cell RNA sequencing revealed that FBXW7 mutations in normal tissue also function by subtly reordering stem cell hierarchies and priming a fetal/regenerative phenotype through upregulation of YAP/TAZ signaling. Further analysis using transposase-accessible chromatin sequencing found this cellular plasticity was driven by changes in the chromatin accessibility of 36 transcriptional start site regions associated with TEAD1/TEAD2 motifs, which in turn upregulated YAP. Taken together, we demonstrate a critical role of FBXW7 mutations in preventing the initiation of colorectal cancer, and provide exemplar evidence for the importance of epistasis and mutational order in cancer biology.

Abstract Cancer genomic medicine relies on targeting driver genes. However, current catalogues of cancer drivers are mostly based on indirect measurements of mutation frequencies, positions or types, rather than their effect on clonal expansions in vivo . Moreover, non-genetic drivers are largely unknown, as are the epigenetic and transcriptomic effects of genetic drivers. Here we perform spatial computational inference on multiomic data with matched whole-genome sequencing, ATAC-seq and RNA-seq. Using 436 samples, we directly quantify the contribution, or lack thereof, of putative driver genes to subclonal expansions in vivo in 30 colorectal carcinomas (4-33 samples per patient, median=15). Although subclonal neutral evolution was widespread (13/26 cases with sufficient data), there were cases with clear evidence of subclonal selection (6/26) in which we measured epigenetic and transcriptomic differences between subclones in vivo . In 7/26 cases we could not distinguish between neutral or selective evolution with the available data. We identified expanding subclones that were not driven by known genetic alterations, and propose candidate epigenetic drivers. We identified the distinguishing patterns of genomic heterogeneity produced in fast, exponentially growing tumours (7/26) versus neoplasms growing only at the periphery (19/26), as well as identifying clonally intermixed (16/28 cases with sufficient data) versus segregated malignancies (10/28). Our model-based approach measures genetic and non-genetic subclonal selection, or lack thereof, in space and time and allows in vivo comparisons of the emergent phenotypic properties of subclones within human tumours.

Cancer evolution is driven by the acquisition of somatic mutations that provide cells with a beneficial phenotype in a changing microenvironment. However, mutations that give rise to neoantigens, novel cancer-specific peptides that elicit an immune response, are likely to be disadvantageous. Here we show how the clonal structure and immunogenotype of growing tumours is shaped by negative selection in response to neoantigenic mutations. We construct a mathematical model of neoantigen evolution in a growing tumour, and verify the model using genomic sequencing data. The model predicts that, in the absence of active immune escape mechanisms, tumours either evolve clonal neoantigens (antigen-'hot'), or have no clonally-expanded neoantigens at all (antigen-'cold'), whereas antigen-'warm' tumours (with high frequency subclonal neoantigens) form only following the evolution of immune evasion. Counterintuitively, strong negative selection for neoantigens during tumour formation leads to an increased number of antigen-warm or -hot tumours, as a consequence of selective pressure for immune escape. Further, we show that the clone size distribution under negative selection is effectively-neutral, and moreover, that stronger negative selection paradoxically leads to more neutral-like dynamics. Analysis of antigen clone sizes and immune escape in colorectal cancer exome sequencing data confirms these results. Overall, we provide and verify a mathematical framework to understand the evolutionary dynamics and clonality of neoantigens in human cancers that may inform patient-specific immunotherapy decision-making.

Abstract Colorectal malignancies are a leading cause of cancer death. Despite large-scale genomic efforts, DNA mutations do not fully explain malignant evolution. Here we study the co-evolution of the genome and epigenome of colorectal tumours at single-clone resolution using spatial multi-omic profiling of individual glands. We collected 1,373 samples from 30 primary cancers and 9 concomitant adenomas and generated 1,212 chromatin accessibility profiles, 527 whole-genomes and 297 whole-transcriptomes. We found positive selection for DNA mutations in chromatin modifier genes and recurrent chromatin changes in regulatory regions of cancer drivers with otherwise no mutation. Genome-wide alterations in transcription factor binding accessibility involved CTCF , downregulation of interferon, and increased accessibility for SOX and HOX , indicating developmental genes reactivation. Epigenetic aberrations were heritable, distinguishing adenomas from cancers. Mutational signature analysis showed the epigenome influencing DNA mutation accumulation. This study provides a map of (epi)genetic tumour heterogeneity, with fundamental implications for understanding colorectal cancer biology.

ABSTRACT Immune system control is a major hurdle that cancer evolution must circumvent. The relative timing and evolutionary dynamics of subclones that have escaped immune control remain incompletely characterized, and how immune-mediated selection shapes the epigenome has received little attention. Here, we infer the genome- and epigenome-driven evolutionary dynamics of tumour-immune coevolution within primary colorectal cancers (CRCs). We utilise our existing CRC multi-region multi-omic dataset that we supplement with high-resolution spatially-resolved neoantigen sequencing data and highly multiplexed imaging of the tumour microenvironment (TME). Analysis of somatic chromatin accessibility alterations (SCAAs) reveals frequent somatic loss of accessibility at antigen presenting genes, and that SCAAs contribute to silencing of neoantigens. We observe that strong immune escape and exclusion occur at the outset of CRC formation, and that within tumours, including at the microscopic level of individual tumour glands, additional immune escape alterations have negligible consequences for the immunophenotype of cancer cells. Further minor immuno-editing occurs during local invasion and is associated with TME reorganisation, but that evolutionary bottleneck is relatively weak. Collectively, we show that immune evasion in CRC follows a “Big Bang” evolutionary pattern, whereby genetic, epigenetic and TME-driven immune evasion acquired by the time of transformation defines subsequent cancer-immune evolution.

Abstract Molecular clocks record cellular ancestry. However, currently used clocks ‘tick too slowly’ to measure the short-timescale dynamics of cellular renewal in adult tissues. Here we develop ‘rapidly oscillating DNA methylation clocks’ where ongoing (de)methylation causes the clock to ‘tick-tock’ back-and-forth between methylated and unmethylated states like a pendulum. We identify oscillators using standard methylation arrays and develop a mathematical modelling framework to quantitatively measure human adult stem cell dynamics from these data. Small intestinal crypts were inferred to contain slightly more stem cells than colon (6.5 ± 1.0 vs 5.8 ± 1.7 stem cells/crypt) with slower stem cell replacement in small intestine (0.79 ± 0.5 vs 1.1 ± 0.8 replacements/stem cell/year). Germline APC mutation increased the number of replacements per crypt (13.0 ± 2.4 replacements/crypt/year vs 6.9 ± 4.6 for healthy colon). In blood, we measure rapid expansion of acute leukaemia and slower growth of chronic disease. Rapidly oscillating molecular clocks are a new methodology to quantitatively measure human somatic cell dynamics.