The RNA-guided Cas9 system represents a flexible approach for genome editing in plants. This method can create specific mutations that knock-out or alter target gene function. It provides a valuable tool for plant research and offers opportunities for crop improvement. We investigate the use and target specificity requirements of RNA-guided Cas9 genome editing in barley (Hordeum vulgare) and Brassica oleracea by targeting multicopy genes. In barley, we target two copies of HvPM19 and observe Cas9-induced mutations in the first generation of 23 % and 10 % of the lines, respectively. In B. oleracea, targeting of BolC.GA4.a leads to Cas9-induced mutations in 10 % of first generation plants screened. In addition, a phenotypic screen identifies T0 plants with the expected dwarf phenotype associated with knock-out of the target gene. In both barley and B. oleracea stable Cas9-induced mutations are transmitted to T2 plants independently of the T-DNA construct. We observe off-target activity in both species, despite the presence of at least one mismatch between the single guide RNA and the non-target gene sequences. In barley, a transgene-free plant has concurrent mutations in the target and non-target copies of HvPM19. We demonstrate the use of RNA-guided Cas9 to generate mutations in target genes of both barley and B. oleracea and show stable transmission of these mutations thus establishing the potential for rapid characterisation of gene function in these species. In addition, the off-target effects reported offer both potential difficulties and specific opportunities to target members of multigene families in crops.

The Arabidopsis seedpod opens through a spring-loaded mechanism known as pod shatter, which is essential for dispersal of the seeds. Here, we identify INDEHISCENT (IND), an atypical bHLH protein, that is necessary for fruit opening and is involved in patterning each of the three fruit cell types required for seed dispersal. Previous studies suggested that FRUITFULL (FUL), a member of the MADS-domain transcription factor family, is required for fruit growth since ful mutant fruit fail to undergo the dramatic enlargement that normally occurs after fertilization. Here we show, however, that FUL is not directly required for fruit elongation and instead is required to prevent ectopic activity of IND. Our molecular and genetic studies suggest a model for the regulatory interactions among the genes that control fruit development and the mechanism that results in the expression of IND in a narrow stripe of cells.

Summary We sought to quantify the role of MYB28 in the regulation of aliphatic glucosinolate biosynthesis and associated sulphur metabolism in field-grown B. oleracea with the use of CRISPR-Cas9-mediated gene editing technology. We describe the first characterised myb28 knockout mutant in B. oleracea , and the first UK field trial of CRISPR-Cas9-mediated gene edited plants under the European Court of Justice interpretation of the 2001/18 EU GMO directive. We report that knocking-out myb28 results in downregulation of aliphatic glucosinolate biosynthesis genes and reduction in accumulation of the methionine-derived glucosinolate, glucoraphanin, in leaves and florets of field-grown myb28 mutant broccoli plants. There were no significant changes to the accumulation of sulphate, S-methyl cysteine sulfoxide and indole glucosinolate in leaf and floret tissues.

Multicellular organisms perceive and transduce multiple cues to optimize developmental reprogramming and cell state switching. Key transcription factors drive developmental changes, but transitions also require the attenuation of previous states. Here, we demonstrate that the mRNA levels of the LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN 3 (LBD3) / ASYMMETRIC LEAVES 2-LIKE 9 (ASL9) transcription factor are directly regulated by mRNA decapping. Capped ASL9 transcripts accumulate in decapping deficient plants and ASL9 mRNAs are found together with decapping components. Accumulation of ASL9 inhibits apical hook and lateral roots formation and interestingly, exogenous auxin application restores lateral roots formation in both ASL9 overexpressor and mRNA decay-deficient mutants. Moreover, mutations in the cytokinin transcription factors type-B ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS (B-ARRs) ARR10 and ARR12 restore the developmental defects in apical hooking and lateral root formation caused by over-accumulation of capped ASL9 transcript upon ASL9 overexpression. Thus, the mRNA decay machinery directly targets ASL9 transcripts for decay to balance cytokinin/auxin responses during developmental reprogramming.

Hormonal signalling in animals often involves direct transcription factor-hormone interactions that modulate gene expression[1][1], [2][2]. In contrast, plant hormone signalling is most commonly based on de-repression via the degradation of transcriptional repressors[3][3]. Recently, we uncovered a non-canonical signalling mechanism for the plant hormone auxin in organ development with strong similarity to animal hormonal pathways. In this mechanism, auxin directly affects the activity of the auxin response factor ETTIN (ETT) towards regulation of target genes without the requirement for protein degradation[4][4], [5][5]. Here we show that auxin binds ETT to modulate gene expression and that this ETT-auxin interaction leads to the dissociation of ETT from co-repressor proteins of the TOPLESS/TOPLESS-RELATED family followed by histone acetylation and the induction of target gene expression. Whilst canonical ARFs are classified as activators or repressors[6][6], ETT is able to switch chromatin locally between repressive and de-repressive states in an instantly-reversible auxin-dependent manner. [1]: #ref-1 [2]: #ref-2 [3]: #ref-3 [4]: #ref-4 [5]: #ref-5 [6]: #ref-6

Abstract Gynoecium polarity establishment is regulated by auxin, a phytohormone whose signal is transduced through several pathways. The relationship between the ETT and canonical TIR1/AFB pathways, and their relevance for carpel development beyond Arabidopsis thaliana , have not been investigated. The data presented here show that the expression patterns of canonical and ETT-mediated signalling components, and phenotypes of higher order mutants are shared between Arabidopsis and Capsella rubella . tir1 afb2 ett mutants partially phenocopy ett arf4 double mutants, suggesting a role for AUXIN RESPONSE FACTOR 4 (ARF4) in the integration of canonical and ETT-mediated signalling. Comparative transcriptomics revealed that the auxin-independent mis-regulation of YABBY genes correlate with patterning defects observed in Arabidopsis ett arf4 mutants. Together, the data presented suggest conserved synergism between canonical and ETT-mediated pathways in gynoecium polarity establishment in the Brassicaceae . Finally, the data suggest that ETT/ARF4 function to prevent the auxin-induced expression of a range of targets in Arabidopsis , consistent with activator-repressor ARF antagonism, and implying that the maintenance of auxin insensitivity by repressive ARFs is important for a range of biological processes. Summary Statement Here the relationship between canonical and ETT-mediated auxin signalling machineries is investigated in Arabidopsis and Capsella revealing conserved synergism between these two pathways in Brassicaceae with distinct fruit shapes.

In the 1980s, plant scientists descended on a small weed Arabidopsis thaliana (thale cress) and developed it into a powerful model system to study plant biology. The massive advances in genetics and genomics since then has allowed us to obtain incredibly detailed knowledge on specific biological processes of Arabidopsis growth and development, its genome sequence and the function of many of the individual genes. This wealth of information provides immense potential for translation into crops to improve their performance and address issues of global importance such as food security. Here we describe how fundamental insight into the genetic mechanism by which seed dispersal occurs in members of the Brassicaceae family can be exploited to reduce seed loss in oilseed rape (Brassica napus). We demonstrate that by exploiting data on gene function in model species, it is possible to adjust the pod-opening process in oilseed rape thereby significantly increasing yield. Specifically, we identified mutations in multiple paralogues of the INDEHISCENT and GA4 genes in B. napus and have overcome genetic redundancy by combining mutant alleles. Finally, we present novel software for the analysis of pod shatter data that is applicable to any crop for which seed dispersal is a serious problem. These findings highlight the tremendous potential of fundamental research in guiding strategies for crop improvement.

Abstract Multicellular organisms perceive and transduce multiple cues to optimize development. Key transcription factors drive developmental changes, but RNA processing also contributes to tissue development. Here, we report that multiple decapping deficient mutants share developmental defects in apical hook, primary and lateral root growth. More specifically, LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN 3 ( LBD3 )/ ASYMMETRIC LEAVES 2-LIKE 9 ( ASL9 ) transcripts accumulate in decapping deficient plants and can be found in complexes with decapping components. Accumulation of ASL9 inhibits apical hook, primary root growth and lateral root formation. Interestingly, exogenous auxin application restores lateral roots formation in both ASL9 over-expressors and mRNA decay-deficient mutants. Likewise, mutations in the cytokinin transcription factors type-B ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS (B-ARRs) ARR10 and ARR12 restore the developmental defects caused by over-accumulation of capped ASL9 transcript upon ASL9 overexpression. Most importantly, loss-of-function of asl9 partially restores apical hook and lateral root formation in decapping deficient mutants. Thus, the mRNA decay machinery directly targets ASL9 transcripts for decay, possibly to interfere with cytokinin/auxin responses, during development.

The phytohormone auxin affects processes throughout plant growth and development. While auxin signalling has been mainly attributed to a repressor degradation-based pathway, numerous alternative mechanisms for how auxin mediates its effect have been revealed in recent years. One such mechanism involves a direct auxin-induced switch in the transcriptional regulatory activity of the Auxin Response Factor (ARF) ETTIN (ETT). ETT lacks a conserved C-terminus domain involved in canonical pathway interactions but contains a middle region domain mediating auxin binding. As the ETT clade only exists in the angiosperms, it remains unknown when the pathway evolved. Here we provide evidence for a two-step origin of the ETT clade and its neofunctionalisation through the gain of auxin perception in gynoecium patterning. Phylogenetic analyses reveal the structural divergence of ETT and its paralogue ARF4 after their duplication from an ancestral euphyllophyte ARF3/4 clade. Auxin sensitivity was identified as an ETT-specific innovation that likely originated in the last common angiosperm ancestor. Furthermore, in planta complementation experiments demonstrated the full genetic redundancy of ETT and ARF4 in leaf and ovary development, but a specialised role for the ETT-mediated auxin signalling pathway in style development. Our work thus provides evidence that ETT was recruited from an ancestral role in leaf development and subsequently underwent neofunctionalisation through the acquisition of direct auxin sensing for a novel role in gynoecium patterning.

Abstract Background A diet rich in cruciferous vegetables is reported to have beneficial health effects, partially mediated by 4-methylsulfinylbutyl glucosinolate, or glucoraphanin, which is predominantly found within broccoli ( Brassica oleracea var italica ). We describe the downstream effects on transcription and metabolism in broccoli following the introgression of a genetic variant of MYB28 into broccoli from a wild Brassica relative which has previously been associated with enhancement of glucoraphanin. Results Whole genome sequencing, RNA expression and metabolite analyses were used to characterise the consequences of the introgression of either one or two copies of a genetic variant of the MYB28 transcription factor into a commercial broccoli genetic background. The introgression of the variant of MYB28 resulted in enhanced expression of genes involved in primary sulphate assimilation, sulphur metabolism and aliphatic glucosinolate biosynthesis, and enhanced accumulation of 4-methylsulphinyl butyl glucosinolate in florets. Other changes in transcription that may be related to non-targeted introgression events are reported. There were no consistent effects upon sulphur metabolites pools, apart from methionine-derived glucosinolates. Conclusion This study illustrates the downstream effects on transcription and metabolism of the introgression of a genetic variant of MYB28 from a wild species into a commercial broccoli genotype.