ABSTRACT Diverse influenza A viruses (IAVs) circulate in wild birds, including dangerous strains that infect poultry and humans. Consequently, surveillance of IAVs in wild birds is a cornerstone of outbreak prevention and pandemic preparedness. Surveillance is traditionally done by testing birds, but dangerous IAVs are rarely detected before outbreaks begin. Testing environmental specimens from wild bird habitats has been proposed as an alternative. These specimens are thought to contain diverse IAVs deposited by broad range of avian hosts, including species that are not typically sampled by surveillance programs. We developed a targeted genomic sequencing method for recovering IAV genome fragments from these challenging environmental specimens, including purpose-built bioinformatic analysis tools for counting, subtyping, and characterizing each distinct fragment recovered. We demonstrated our method on 90 sediment specimens from wetlands around Vancouver, Canada. We recovered 2,312 IAV genome fragments originating from all 8 IAV genome segments. 11 haemagglutinin (HA) subtypes and 9 neuraminidase subtypes were detected, including H5, the current global surveillance priority. Recovered fragments originated predominantly from IAV lineages that circulate in North American resident wild birds. Our results demonstrate that targeted genomic sequencing of environmental specimens from wild bird habitats can be a valuable complement to avian influenza surveillance programs.

ABSTRACT Background Sequencing viruses in many specimens is hindered by excessive background material from hosts, microbiota, and environmental organisms. Consequently, enrichment of target genomic material is necessary for practical high-throughput viral genome sequencing. Hybridization probes are widely used for enrichment in many fields, but their application to viral sequencing faces a major obstacle: it is difficult to design panels of probe oligo sequences that broadly target many viral taxa due to their rapid evolution, extensive diversity, and genetic hypervariability. To address this challenge, we created ProbeTools, a package of bioinformatic tools for generating effective viral capture panels, and for assessing coverage of target sequences by probe panel designs in silico . In this study, we validated ProbeTools by designing a panel of 3,600 probes for subtyping the hypervariable haemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genome segments of avian-origin influenza A viruses (AIVs). Using in silico assessment of AIV reference sequences and in vitro capture on egg-cultured viral isolates, we demonstrated effective performance by our custom AIV panel and ProbeTools’ suitability for challenging viral probe design applications. Results Based on ProbeTool’s in silico analysis, our panel provided broadly inclusive coverage of 14,772 HA and 11,967 NA reference sequences. 90% of these HA and NA references sequences had 90.8% and 95.1% of their nucleotide positions covered in silico by the panel respectively. We also observed effective in vitro capture on a representative collection of 23 egg-cultured AIVs that included isolates from wild birds, poultry, and humans and representatives from all HA and NA subtypes. 42 of 46 HA and NA segments had over 98.3% of their nucleotide positions significantly enriched by our custom panel. These in vitro results were further used to validate ProbeTools’ in silico coverage assessment algorithm; 89.2% of in silico predictions were concordant with in vitro results. Conclusions ProbeTools generated an effective panel for subtyping AIVs that can be deployed for genomic surveillance, outbreak prevention, and pandemic preparedness. Effective probe design against hypervariable AIV targets also validated ProbeTools’ design and coverage assessment algorithms, demonstrating their suitability for other challenging viral capture applications.

Once restricted to northern China and Mongolia, the brown rat (Rattus norvegicus) now enjoys a worldwide distribution due to the evolution of commensalism with humans. In contrast to black rats and the house mouse, which have tracked the regional and global development of human agricultural settlements, brown rats do not appear in the European historical record until the 1500s, suggesting their range expansion was a response to relatively recent increases in global trade and modern sea-faring. We inferred the global phylogeography of brown rats using 32k SNPs to reconstruct invasion routes from estimates of population divergence and admixture. Globally, we detected 13 evolutionary clusters within five expansion routes. One cluster arose following a southward expansion into Southeast Asia. Three additional clusters arose from two independent eastward expansions: one expansion from Russia to the Aleutian Archipelago, and a second to western North America. Rapid westward expansion resulted in the colonization of Europe from which subsequent colonization of Africa, the Americas, and Australasia occurred, and multiple evolutionary clusters were detected. An astonishing degree of fine-grained clustering found both between and within our sampling sites underscored the extent to which urban heterogeneity can shape the genetic structure of commensal rodents. Surprisingly, few individuals were recent migrants despite continual global transport, suggesting that recruitment into established populations is limited. Understanding the global population structure of R. norvegicus offers novel perspectives on the forces driving the spread of zoonotic disease, and yields greater capacity to develop targeted rat eradication programs.

Abstract In December 2021, influenza A viruses (IAV) were detected in a population of farmed mink in British Columbia, Canada. Based on genomic sequencing and phylogenetic analysis, these IAVs were subtyped as H3N2s that originated from reassortment of swine H3N2 (clade 1990.4h), human seasonal H1N1 (pdm09), and swine H1N2 (clade 1A.1.1.3). This reassortant has been subsequently observed in swine in several Midwest American states, as well as in swine and turkeys in Ontario, suggesting its spillover into farmed mink in British Columbia was incidental to its broader dissemination in North American swine populations. These detections reaffirm the need for extensive genomic surveillance of IAVs in swine populations to monitor reassortments that might become public health concerns. They also highlight the need for closer surveillance of IAVs in mink to preserve animal health, protect agricultural interests, and monitor potential zoonotic threats.

Abstract Introduction During an investigation into a cluster of Shigella flexneri serotype 2a cases in an underserved community, we assessed the relatedness of human and rat S. flexneri isolates utilizing a novel PCR targeting insertion sites (IS-PCR) of mobile elements in the Shigella genome characteristic of the cluster strain. Methods Whole genome sequences of S. flexneri (n=50) associated with the cluster were analyzed. de novo genome assemblies were analyzed by a Geneious V10.2.6 motif search, and 2 unique IS were identified in all human Shigella sequences of the local cluster. Hydrolysis probe PCR assays were designed to detect these sequences consisting of forward and reverse primers to amplify across each insertion site, and a hydrolysis probe spanning the insertion site. IS-PCR was performed for three Shigella PCR-positive culture-negative rat intestine specimens from this community. Results Both insertion sites were detected in the de novo genome assemblies of all clinical S. flexneri isolates (n=50). Two of the three PCR-positive culture-negative rat samples were positive for both unique IS identified in the human S. flexneri isolates, suggesting that the rat Shigella spp. strains were closely related to the human strains in the cluster. The cycle threshold (Ct) values were >35, indicating that the bacterial load was very low in the rat samples. Conclusions Two unique IS were identified in clinical isolates from a community S. flexneri cluster. Both IS targets were identified in PCR-positive ( Shigella spp.), culture-negative rat tissue and clinical isolates from humans, indicating relatedness.

Abstract Chimeric Antigen receptor T cell (CAR-T) treatments for solid cancers have been compromised by limited expansion and survival in the tumor microenvironment following interaction with antigen-expressing target cells. Using B7H3 as a model antigen with broad clinical applicability, we evaluated the relationship between the antibody/antigen affinity of three clinical candidate binders and the three following functional characteristics: functional avidity, prolonged cytotoxicity in tumoroid re-stimulation assays, and in vivo anti-tumoral responses. BEHAV3D video-microscopy assessed distinct CAR-T cell behaviors at single cell resolution. T cell exhaustion did not dictate effector function. Rather, we demonstrated a threshold avidity of CAR-T / tumor cell interaction, characterized by longer cumulative CD8 + CAR-T / tumor target interaction times, and required for adequate CAR-T cell expansion to result in sustained tumor control upon re-challenge. These results provide new insights into design of CAR-T cells for antigen-dim cell targeting, and avoidance of antigen-dim tumor relapse.

Salmonella Dublin is a bovine-adapted bacterial pathogen that primarily affects dairy cattle. The incidence of S . Dublin has been increasing across North America, including strains that are multidrug resistant. In British Columbia, the Ministry of Agriculture’s Animal Health Center (AHC) reported an increase in cases since 2015, warranting an investigation into how S . Dublin is spreading within the province. The objectives of this study were to make use of historical data collected from dairy farms across the province to (1) describe S . Dublin cases diagnosed at the AHC between 2007 and 2021, (2) identify risk factors for S . Dublin transmission across British Columbia dairy farms, and (3) identify any potential biases associated with passive laboratory-based data that may apply to our results. We found that S . Dublin cases diagnosed at the AHC have been increasing over time. Over half of the cases had respiratory symptoms; however, clinical signs tended to be highly variable. The prevalence of respiratory symptoms was mirrored by florfenicol treatment and was suggested to be due to using a first-line antibiotic for more common causes of pneumonia when presented with an S . Dublin case. Calves were 38 times more likely to have S . Dublin when compared to adults (odds ratio = 38.43, confidence interval = 7.26–203.64), and given the sample population (postmortem cases), it is reasonable to conclude clinical disease is most severe in this age group. Farm premise accounted for a large amount of variability within our model (92% of unexplained variance), suggesting that farm-level management practices may be the most important risk factor for S . Dublin infection. In total, only 54% of BC dairy farms submitted to the laboratory between 2007 and 2021; however, proximity to the laboratory did not appear to influence submissions as proportionally; farms within the Fraser Valley submitted as frequently as farms from other regions. We strongly suggest that future work explore factors associated with farm management practices, given our findings regarding the clustering by premises.

Abstract While chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are showing highly promising first results in neuroblastoma, immunosuppressive tumor microenvironments (TME) limit T cell persistence and durable clinical efficacy. To improve CAR T-cell efficacy further, we applied a multi-omics approach including single-cell RNA sequencing and proteomics, which identified 13 targetable immunosuppressive factors in neuroblastoma. Of these, macrophage migration inhibitory factor (MIF) and midkine (MDK) were validated across multiple published RNA datasets. Moreover, they were secreted in high abundance by neuroblastoma tumoroids. Functional validation experiments revealed MIF as a potent inhibitor of CAR T-cells, in vitro and in vivo. Degradation of MIF by PROTAC technology significantly enhanced CAR T-cell activation targeting GPC2 and B7-H3, providing a potential intervention against MIF. By defining the immunosuppressive effects of neuroblastoma’s TME on CAR T-cell efficacy, particularly the pivotal role of MIF, we provide a therapeutic strategy for improving adoptive cell therapies for this pediatric malignancy.