Previous studies have demonstrated a synergistic interaction between rhuMAb HER2 and the cytotoxic drug cisplatin in human breast and ovarian cancer cells. To define the nature of the interaction between rhuMAb HER2 and other classes of cytotoxic drugs, we applied multiple drug effect/combination index (CI) isobologram analysis to a variety of chemotherapeutic drug/rhuMAb HER2 combinations in vitro. Synergistic interactions at clinically relevant drug concentrations were observed for rhuMAb HER2 in combination with cisplatin (CI=0.48, P=0.003), thiotepa (CI=0.67, P=0.0008), and etoposide (CI=0.54, P=0.0003). Additive cytotoxic effects were observed with rhuMAb HER2 plus doxorubicin (CI=1.16, P=0.13), paclitaxel (CI=0.91, P=0.21), methotrexate (CI=1.15, P=0.28), and vinblastine (CI=1.09, P=0.26). One drug, 5-fluorouracil, was found to be antagonistic with rhuMAb HER2 in vitro (CI=2.87, P=0.0001). In vivo drug/rhuMAb HER2 studies were conducted with HER-2/neu-transfected, MCF7 human breast cancer xenografts in athymic mice. Combinations of rhuMAb HER2 plus cyclophosphamide, doxorubicin, paclitaxel, methotrexate, etoposide, and vinblastine in vivo resulted in a significant reduction in xenograft volume compared to chemotherapy alone (P<0.05). Xenografts treated with rhuMAb HER2 plus 5-fluorouracil were not significantly different from 5-fluorouracil alone controls consistent with the subadditive effects observed with this combination in vitro. The synergistic interaction of rhuMAb HER2 with alkylating agents, platinum analogs and topoisomerase II inhibitors, as well as the additive interaction with taxanes, anthracyclines and some antimetabolites in HER-2/neu-overexpressing breast cancer cells demonstrates that these are rational combinations to test in human clinical trials.

Abstract Epstein-Barr virus (EBV) infection is transmitted by saliva and is a major cause of cancer in people living with HIV/AIDS as well as in the general population. To better understand the determinants of oral EBV shedding we evaluated the frequency and quantity of detectable EBV in the saliva in a prospective cohort study of 85 adults in Uganda, half of whom were co-infected with HIV-1. Participants were not receiving antiviral medications, and those with HIV-1 co-infection had a CD4+ T cell count >200 cells/mm 3 . Daily, self-collected oral swabs were collected over a 4-week period. Compared with HIV-1 uninfected participants, co-infected participants had an increased frequency of oral EBV shedding (IRR=1.27, 95% CI=1.10-1.47). To explain why EBV oral shedding is greater in HIV-1 co-infected participants, we developed a stochastic, mechanistic mathematical model that describes the dynamics of EBV, infected cells, and antiviral cellular immune responses within the tonsillar epithelium, and examined parameter-specific differences between individuals of different HIV-1 infection statuses. We fit the model to our observational data using Approximate Bayesian Computation. After fitting, model simulations showed high fidelity to daily oral shedding time-courses and matched key summary statistics. Examination of the model revealed that higher EBV loads in saliva are driven by B cell activation causing EBV lytic replication in the tonsils, in combination with a less effective EBV-specific cellular immune response. Thus, both these factors contribute to higher and more frequent EBV shedding in HIV-1 co-infected individuals compared to HIV-1 uninfected individuals. These conclusions were further validated by modelling daily oral EBV shedding in a 26-participant North American cohort. Our results provide insights into the determinants of EBV shedding and implicate B cell activation to be a potential therapeutic target to reduce EBV replication in HIV-1 co-infected individuals at high risk for EBV-related malignancies. Author summary Epstein-Barr virus (EBV) is a ubiquitous infection worldwide. Infection with EBV is associated with the development of several kinds of cancer, including B cell lymphoma and nasopharyngeal carcinoma. Rates of EBV replication and disease are higher in individuals who are also infected with HIV-1. HIV-1 infection is associated with increased B cell activation, which is known to induce EBV reactivation, as well as immunodeficiency resulting from loss of T cells. However, whether these factors contribute to higher rates of EBV replication during co-infection, and by how much, was unknown. We analysed oral EBV shedding data in a cohort of adults from Uganda that were chronically infected with EBV. We found that participants that were HIV-1 infected were much more likely to have detectable quantities of EBV in their saliva. Also, when detected, the quantity of EBV present in the saliva was usually higher in HIV-1 infected participants. To better understand these findings, we developed a mathematical model to describe the dynamics of EBV, EBV-infected cells, and the cellular immune response within the tonsils. By rigorously matching our model to our participant data, we determined that high EBV loads in saliva are caused by high rates of infected B cell activation, as well as worse cellular immune control of EBV infection. These results provide an explanation of the impact of HIV-1 on EBV infection. Further, they suggest that strategies that suppress B cell activation may prevent EBV-related malignancy in people who are also infected with HIV-1.

Abstract When B cells encounter antigens on the surface of an antigen-presenting cell (APC), B cell receptors (BCRs) are gathered into microclusters that recruit signaling enzymes. These microclusters then move centripetally and coalesce into the central supramolecular activation cluster of an immune synapse. The mechanisms controlling BCR organization during immune synapse formation, and how this impacts BCR signaling, are not fully understood. We show that this coalescence of BCR microclusters depends on the actin-related protein 2/3 (Arp2/3) complex, which nucleates branched actin networks. Moreover, in murine B cells this dynamic spatial reorganization of BCR microclusters amplifies proximal BCR signaling reactions and enhances the ability of membrane-associated antigens to induce transcriptional responses and proliferation. Our finding that Arp2/3 complex activity is important for B cell responses to spatially-restricted membrane-bound antigens, but not for soluble antigens, highlights a critical role for Arp2/3 complex-dependent actin remodelling in B cell responses to APC-bound antigens.

Abstract Clustering of proteins is crucial for many cellular processes and can be imaged at nanoscale resolution using single-molecule localization microscopy (SMLM). Ideally, molecular clustering in regions of interest (ROIs) from SMLM images would be assessed using computational methods that are robust to sample and experimental heterogeneity, account for uncertainties in localization data, can analyze both 2D and 3D data, and have practical computational requirements in terms of time and hardware. While analyzing surface protein clustering on B lymphocytes using SMLM, we encountered limitations with existing cluster analysis methods. This inspired us to develop StormGraph, an algorithm using graph theory and community detection to identify clusters in heterogeneous sets of 2D and 3D SMLM data while accounting for localization uncertainties. StormGraph generates both multi-level and single-level clusterings and can quantify cluster overlap for two-color SMLM data. Importantly, StormGraph automatically determines scale-dependent thresholds from the data using scale-independent input parameters. This makes identical choices of input parameter values suitable for disparate ROIs, eliminating the need to tune parameters for different ROIs in heterogeneous SMLM datasets. We show that StormGraph outperforms existing algorithms at analyzing heterogeneous sets of simulated SMLM ROIs where ground-truth clusters are known. Applying StormGraph to real SMLM data in 2D, we reveal that B-cell antigen receptors (BCRs) reside in a heterogeneous combination of small and large clusters following stimulation, which suggests for the first time that two conflicting models of BCR activation are not mutually exclusive. We also demonstrate application of StormGraph to real two-color and 3D SMLM data.

The causes of individual variability in the length of time between human immunodeficiency virus (HIV) infection and the development of AIDS are incompletely understood. Here, we present a novel hypothesis: that the relative magnitude of responses to HIV mediated by CD4+ T regulatory (Treg) cells vs. CD4+ T effector (Teff) cells is a critical determinant of variability in AIDS progression rates. We use a simple mathematical model to show that this hypothesis can plausibly explain three qualitatively different outcomes of HIV infection ? fast or slow progression to AIDS, and long-term non-progression to AIDS ? based on individual variation in underlying T-cell response. This hypothesis also provides a unifying explanation for various other empirical observations, suggesting in particular that both aging and certain dual infections increase the rate of AIDS progression because they increase the strength of the Treg cell response. We discuss potential therapeutic implications of our results.

Abstract Human cytomegalovirus (HCMV) is the most common congenital infection. Several HCMV vaccines are in development, but none have yet been approved. An understanding of the kinetics of CMV replication and transmission may inform the rational design of vaccines to prevent this infection. The salivary glands (SG) are an important site of sustained CMV replication following primary infection and during viral reactivation from latency. As such, the strength of the immune response in the SG likely influences viral dissemination within and between hosts. To study the relationship between the immune response and viral replication in the SG, and viral dissemination from the SG to other tissues, mice were infected with low doses of murine CMV (MCMV). Following intra-SG inoculation, we characterized the viral and immunological dynamics in the SG, blood, and spleen, and identified organ-specific immune correlates of protection. Using these data, we constructed compartmental mathematical models of MCMV infection. Model fitting to data and analysis indicate the importance of cellular immune responses in different organs and point to a threshold of infection within the SG necessary for the establishment and spread of infection. Author Summary Cytomegalovirus (CMV) is the most common congenital infection and causes an enormous burden of childhood disease. To gain insight into the immune requirements for controlling infection, we used a mouse model to reproduce characteristics of natural CMV infection, employing a low viral inoculum, and delivering the virus to the salivary glands (SG), a key site of CMV replication. Our results provide detailed data on the spatial and temporal spread of infection throughout the body and identify key immune correlates of the control of viral replication. By translating these findings into mechanistic mathematical models, we revealed the importance of organ-specific immune responses, particularly the requirement of TNF- α and IFN- γ to control infection within the salivary glands. Furthermore, our mathematical modeling allowed us to compare known characteristics of human CMV infection related to infection establishment and spread to those predicted in mice, underscoring the suitability of the MCMV model to study its human homologue. These insights provide guidance for developing targeted vaccines to prevent CMV infection and disease.

Single particle tracking (SPT), where individual molecules are fluorescently labelled and followed over time, is an important tool that allows the spatiotemporal dynamics of subcellular biological systems to be studied at very fine temporal and spatial resolution. Mathematical models of particle motion are typically based on Brownian diffusion, reflecting the noisy environment that biomolecules typically inhabit. In order to study changes in particle behaviour within individual tracks, Hidden Markov models (HMM) featuring multiple diffusive states have been used as a descriptive tool for SPT data. However, such models are typically specified with an a-priori defined number of particle states and it has not been clear how such assumptions have affected their outcomes. Here, we propose a method for simultaneously inferring the number of diffusive states alongside the dynamic parameters governing particle motion. Our method is an infinite HMM (iHMM) within the general framework of Bayesian non-parametric models. We directly extend previous applications of these concepts in molecular biophysics to the SPT framework and propose and test an additional constraint with the goal of accelerating convergence and reducing computational time. We test our iHMM using simulated data and apply it to a previously-analyzed large SPT dataset for B cell receptor motion on the plasma membrane of B cells of the immune system.