Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) hold tremendous promise for in vitro modeling to assess native myocardial function and disease mechanisms as well as testing drug safety and efficacy. However, current iPSC- CMs are functionally immature, resembling in vivo CMs of fetal or neonatal developmental states. The use of targeted culture media and organoid formats have been identified as potential high-yield contributors to improve CM maturation. This study presents a novel iPSC-CM maturation medium formulation, designed using a differential evolutionary approach targeting metabolic functionality for iterative optimization. Relative to gold-standard reference formulations, our medium significantly matured morphology, Ca 2+ handling, electrophysiology, and metabolism, which was further validated by multiomic screening, for cells in either pure or co-cultured microtissue formats. Together, these findings not only provide a reliable workflow for highly functional iPSC-CMs for downstream use, but also demonstrate the power of high-dimensional optimization processes in evoking advanced biological function in vitro.

Abstract Rationale Coupling between right ventricular function and the pulmonary vasculature determines outcomes in pulmonary arterial hypertension. The mechanics of the main pulmonary artery is an important but understudied determinant of right ventricular-pulmonary artery coupling. Objectives To investigate the histology and mechanics of the pulmonary artery in relationship to right ventricular remodeling, mechanics, hemodynamics and coupling in experimental pulmonary arterial hypertension. Methods In a sugen+hypoxia rat model of pulmonary arterial hypertension, right ventricular hemodynamics were assessed by conductance catheters. Active tension-strain curves were generated using echocardiography. Main pulmonary artery and right ventricle free-wall were harvested to determine their macro- and micro-structure, composition, and mechanical properties. Comprehensive multivariate analyses elucidated relationships between pulmonary artery and right ventricle mechanics, structure and coupling. Measurements and Main Results Pulmonary hypertensive main pulmonary arteries developed fibrosis relative to healthy controls, as did right ventricles, which also hypertrophied, with re-orientation of muscle fibres toward a tri-layer architecture reminiscent of normal left ventricular architecture. Increased glycosaminoglycan deposition and increased collagen-to-elastin ratio in the pulmonary artery; and increased collagen, as well as hypertrophy and reorganization of myofibers in the right ventricle, led to increased stiffness. This increase in stiffness was more pronounced in the longitudinal direction in the high- and low-strain regime for the pulmonary artery and right ventricle, respectively, causing increased mechanical anisotropy. Main pulmonary artery stiffening correlated significantly with right ventricular tissue mechanical remodelling and reduced systolic performance, cardiac output and right ventricle-pulmonary artery coupling. Conclusions Compositional, structural, and mechanical changes in the main pulmonary artery correlate with adverse right ventricular remodeling, mechanics, function and coupling in pulmonary arterial hypertension. Therefore, increasing mechanical compliance of the large pulmonary arteries may be an important and novel therapeutic strategy for mitigating right ventricular failure.

Abstract Senescence, particularly in the nucleus pulposus (NP) cells, has been implicated in the pathogenesis of disc degeneration, however, the mechanism(s) of annulus fibrosus (AF) cell senescence is still not well understood. Both TNFα and H 2 O 2 , have been implicated as contributors to the senescence pathways, and their levels are increased in degenerated discs when compared to healthy discs. Thus the objective of this study is to identify factor(s) that induces inner AF (iAF) cell senescence. Under TNFα exposure, at a concentration that can induce senescence in NP cells, bovine iAF cells did not undergo senescence, indicated by their ability to continue to proliferate as demonstrated by Ki67 staining and growth curves and lack of expression of the senescent markers, p16 and p21. Unlike iAF cells, NP cells treated with TNFα accumulated more intracellular ROS and secreted more H 2 O 2 . Following TNFα treatment, only iAF cells had increased expression of the superoxide scavengers SOD1 and SOD2 whereas NP cells had increased NOX4 gene expression, an enzyme that can generate H 2 O 2 . Treating iAF cells with low dose H 2 O 2 (50 μM) induced senescence, however unlike TNFα, H 2 O 2 did not induce degenerative-like changes as there was no difference in COL2, ACAN, MMP13 , or IL6 gene expression or number of COL2 and ACAN immunopositive cells compared to untreated controls. The latter result suggests that iAF cells have distinct degenerative and senescent phenotypes. To evaluate paracrine signalling, iAF and TNFα-treated NP cells were co-cultured. In contact co-culture the NP cells did induce iAF senescence. Thus, senescent NP cells may secrete soluble factors that induce degenerative and senescent changes within the iAF. This may contribute to a positive feedback loop of disc degeneration. It is possible these factors may include H 2 O 2 and cytokines (TNFα). Further studies will investigate if human disc cells respond similarly.

Abstract With an ever-increasing demand for laboratory-grade Cas9 proteins by many groups advancing the use of CRISPR technology, a more efficient and scalable process for generating the proteins, coupled with rapid purification methods is in urgent demand. Here, we introduce a modified methodology for rapid purification of active SaCas9 protein within 24 hours. The product has over 90% protein purity. The simplicity and cost-effectiveness of such methodology will enable general labs to produce a sizable amount of Cas9 proteins, further accelerating the advancement of CRISPR/Cas9-based research.