The cellular energy sensor adenosine monophosphate–activated protein kinase also binds and is regulated by adenosine diphosphate.

The AMP-activated protein kinase (AMPK) is an αβγ heterotrimer that acts as a master metabolic regulator to maintain cellular energy balance following increased energy demand and increases in the AMP/ATP ratio. This regulation provides dynamic control of energy metabolism, matching energy supply with demand that is essential for the function and survival of organisms. AMPK is inactive unless phosphorylated on Thr172 in the α-catalytic subunit activation loop by upstream kinases (LKB1 or calcium-calmodulin-dependent protein kinase kinase β). How a rise in AMP levels triggers AMPK α-Thr172 phosphorylation and activation is incompletely understood. Here we demonstrate unequivocally that AMP directly stimulates α-Thr172 phosphorylation provided the AMPK β-subunit is myristoylated. Loss of the myristoyl group abolishes AMP activation and reduces the extent of α-Thr172 phosphorylation. Once AMPK is phosphorylated, AMP further activates allosterically but this activation does not require β-subunit myristoylation. AMP and glucose deprivation also promote membrane association of myristoylated AMPK, indicative of a myristoyl-switch mechanism. Our results show that AMP regulates AMPK activation at the initial phosphorylation step, and that β-subunit myristoylation is important for transducing the metabolic stress signal.

Abstract AMPK and mTORC1 are nutrient-sensitive protein kinases that form a fundamental negative feedback loop that governs cell growth and proliferation. AMPK is an αβγ heterotrimer that is directly phosphorylated by mTORC1 on α2 S345 to suppress AMPK activity and promote cell proliferation under nutrient stress conditions. Using mass spectrometry, we generated precise phosphorylation profiles of all 12 AMPK complexes expressed in proliferating human cells. Of the 18 phosphorylation sites detected, seven were sensitive to pharmacological mTORC1 inhibition, including four in the AMPK γ2 isoform NH 2 -terminal domain and α2 S377 which is located in the nucleotide-sensing motif. In particular, β1 S182 and β2 S184 were found to be mTORC1 substrates in vitro and near-maximally or substantially phosphorylated under cellular growth conditions. β S182 phosphorylation was elevated in α1-containing complexes, relative to α2, an effect partly attributable to the non-conserved α-subunit serine/threonine-rich loop. While mutation of β1 S182 to a non-phosphorylatable Ala had no effect on basal and ligand-stimulated AMPK activity, β2-S184A mutation increased nuclear AMPK activity and enhanced cell proliferation under nutrient stress. We conclude that mTORC1 governs the nuclear activity of AMPK to regulate transcription factors involved in metabolism and cell survival during nutrient shortage.

ABSTRACT Recent identification of new human muscle glycogen phosphorylation sites has renewed interest in understanding human variations in the regulation of glycogen metabolism and glucose homeostasis. This paper presents a detailed method for the measurement of glycogen phosphorylase (GPh) activity in skeletal muscle. Our approach incorporates modifications to existing radiolabelling assays, optimizing specificity and sensitivity while enabling the assessment of both active and total enzyme activity levels. The utilization of radioisotope tracers and scintillation counting ensures accurate quantification of GPh activity, which we use to validate a previously published reduction in GPh activity in an Actn3 deficient mouse model. Moreover, we introduce a step-by-step guide for data acquisition, highlight the use of appropriate homogenization, discuss the need for allosteric activators/inhibitors and the importance of assay optimization to record a GPh activity assay for skeletal muscle. In conclusion, our refined method not only contributes to a deeper understanding of glycogen metabolism in muscle tissue but also provides a framework for future investigations, underscoring its role in advancing research on glycogen utilization and glucose homeostasis. NEW & NOTEWORTHY The study optimizes the glycogen phosphorylase radiolabelled activity assay, unveiling nuances in muscle homogenization, sample dilution, and caffeine inclusion. The research introduces standardized conditions, enhancing assay reliability and reproducibility across mouse strains to reveal sex specific variations in GPh activity and underscore novel distinctions in an Actn3 deficient mouse model. These findings advance our understanding of muscle glycogen metabolism, offering a crucial tool for researchers and facilitating meaningful inter-laboratory comparisons.

Meteorin-like (metrnl) is a recently identified adipomyokine that has beneficial effects on glucose metabolism. However, its underlying mechanism of action is not completely understood. In this study, we have shown that a level of metrnl increase in vitro under electrical-pulse-stimulation (EPS) and in vivo in exercise mice, suggesting that metrnl is an exercise-induced myokine. In addition, metrnl increases glucose uptake through the calcium-dependent AMPK pathway. Metrnl also increases the phosphorylation of HDAC5, a transcriptional repressor of GLUT4, in an AMPK-dependent manner. Phosphorylated HDAC5 interacts with 14-3-3 proteins and sequesters them in the cytoplasm, resulting in the activation of GLUT4 transcription. The intraperitoneal injection of recombinant metrnl improves glucose tolerance in mice with high fat-induced obesity or type 2 diabetes (db/db), but this is not seen in AMPK muscle-specific null mice (AMPK MKO). In conclusion, we have demonstrated that metrnl induces beneficial effects on glucose metabolism via AMPK and is a promising therapeutic candidate for glucose-related diseases such as type 2 diabetes.