Liquid-liquid phase transitions in complex mixtures of proteins and other molecules produce crowded compartments supporting in vitro transcription and translation. We developed a method based on picoliter water-in-oil droplets to induce coacervation in Escherichia coli cell lysate and follow gene expression under crowded and noncrowded conditions. Coacervation creates an artificial cell-like environment in which the rate of mRNA production is increased significantly. Fits to the measured transcription rates show a two orders of magnitude larger binding constant between DNA and T7 RNA polymerase, and five to six times larger rate constant for transcription in crowded environments, strikingly similar to in vivo rates. The effect of crowding on interactions and kinetics of the fundamental machinery of gene expression has a direct impact on our understanding of biochemical networks in vivo. Moreover, our results show the intrinsic potential of cellular components to facilitate macromolecular organization into membrane-free compartments by phase separation.

Abstract Stochastic fluctuations in gene expression (‘noise’) are often considered detrimental but, in other fields, fluctuations are harnessed for benefit (e.g., ‘dither’ or amplification of thermal fluctuations to accelerate chemical reactions). Here, we find that DNA base-excision repair amplifies transcriptional noise, generating increased cellular plasticity and facilitating reprogramming. The DNA-repair protein Apex1 recognizes modified nucleoside substrates to amplify expression noise—while homeostatically maintaining mean levels of expression— for virtually all genes across the transcriptome. This noise amplification occurs for both naturally occurring base modifications and unnatural base analogs. Single-molecule imaging shows amplified noise originates from shorter, but more intense, transcriptional bursts that occur via increased DNA supercoiling which first impedes and then accelerates transcription, thereby maintaining mean levels. Strikingly, homeostatic noise amplification potentiates fate-conversion signals during cellular reprogramming. These data suggest a functional role for the observed occurrence of modified bases within DNA in embryonic development and disease.

Abstract Cell fate decisions are ubiquitous and play a critical role throughout development, yet how localization impacts cellular decision making remains unclear. To identify the drivers of position-dependent fate decisions at a molecular level, we developed a scalable a ntibody and m R NA t argeting seq uential f luorescence i n s itu h ybridization (ARTseq-FISH) method capable of simultaneously profiling mRNAs, proteins and phosphoproteins in single cells at sub-micrometre spatial resolution. We studied 67 unique (phospho-)protein and mRNA targets in individual mouse embryonic stem cells (mESCs) cultured on circular micropatterns, yielding quantification of both abundance and localization of mRNAs and (phospho-)proteins during the first 48 hours of differentiation. ARTseq-FISH revealed a fate decision between continued self-renewal and differentiation that relies solely on the position of each mESC on the micropattern. Our results demonstrate that temporal changes in cell cycle orchestrate these position-dependent cell fate decisions.

Poly(A) tails are crucial for mRNA translation and degradation, but the exact relationship between tail length and mRNA kinetics remains unclear. Here, we employ a small library of identical mRNAs that differ only in their poly(A)-tail length to examine their behavior in human embryonic kidney cells. We find that tail length strongly correlates with mRNA degradation rates but is decoupled from translation. Interestingly, an optimal tail length of ∼100 nt displays the highest translation rate, which is identical to the average endogenous tail length measured by nanopore sequencing. Furthermore, poly(A)-tail length variability—a feature of endogenous mRNAs—impacts translation efficiency but not mRNA degradation rates. Stochastic modeling combined with single-cell tracking reveals that poly(A) tails provide cells with an independent handle to tune gene expression fluctuations by decoupling mRNA degradation and translation. Together, this work contributes to the basic understanding of gene expression regulation and has potential applications in nucleic acid therapeutics.

Abstract Human cancers can exhibit phenotype switching, resulting in cells that are more metastatic or that are more tolerant to treatment. However, the relationship between these aggressive states is not well understood. We investigated the dynamics of phenotypic switching in human melanoma cells by monitoring the fluorescent activity from a transgenic reporter of BRN2 promoter activation. Melanoma cells exhibit heterogeneous BRN2 expression patterns that are reestablished upon isolation and clonal outgrowth. Specifically, stable BRN2 expression was generally inherited over multiple generations while undergoing occasional bidirectional interconversion. We found that BRN2 low cells were required for tumor initiation and metastasis in animal engraftment assays but were more sensitive to targeted BRAF inhibition. In contrast, the BRN2 high state was not tumorigenic, but entry into this state was uniform and persistent among cells tolerant to targeted BRAF therapy. Single-cell RNA sequencing analyses revealed core programs exclusive to either the BRN2 high or low cells, each of which is present in ex vivo tumors, demonstrating the physiological relevance of these states. Our findings emphasize that one challenge of effectively targeting phenotype switching in melanoma as a therapeutic strategy could be balancing distinct aggressive phenotypes so that sensitizing tumors to BRAF inhibition does not inadvertently lead to further dissemination. Teaser Unraveling melanoma’s shape-shifting behavior: insights into how cancer cells swap between metastasis and drug evasion.

SUMMARY Co-expression of genes measured with single-cell RNA sequencing is extensively utilized to understand the principles of gene regulation within and across cell types and species. It is assumed that the presence of correlation in gene expression values at the single-cell level demonstrates the existence of common regulatory mechanisms. However, the regulatory mechanisms that should lead to observed co-expression at an mRNA level often remain unexplored. Here we investigate the relationship between processes upstream and downstream of transcription (i.e., promoter architecture and coordination, DNA contact frequencies and mRNA degradation) and pairwise gene expression correlations at an mRNA level. We identify that differences in mRNA degradation (i.e., half-life) is a pivotal source of single-cell correlations in mRNA levels independently of the presence of common regulatory mechanisms. These findings reinforce the necessity of including post-transcriptional regulation mechanisms in the analysis of gene expression in mammalian cells.

SUMMARY Poly(A)-tails are crucial for mRNA translation and degradation, but the exact relationship between tail length and mRNA kinetics remains unclear. Here we employ a small library of identical mRNAs that differ only in their poly(A)-tail length to examine their behavior in human embryonic kidney cells. We find that tail length strongly correlates with mRNA degradation rates, but is decoupled from translation. Interestingly, an optimal tail length of ∼100 nucleotides displays the highest translation rate, which is identical to the average endogenous tail length measured by nanopore sequencing. Furthermore, poly(A)-tail length variability––a feature of endogenous mRNAs––impacts translation efficiency but not mRNA degradation rates. Stochastic modelling combined with single-cell tracking reveals that poly(A)-tails provide cells with an independent handle to tune gene expression fluctuations by decoupling mRNA degradation and translation. Together, this work contributes to the basic understanding of gene expression regulation and has potential applications in nucleic acid therapeutics.

Diverse biological systems utilize gene-expression fluctuations (noise) to drive lineage-31 commitment decisions1-5. However, once a commitment is made, noise becomes detrimental 32 to reliable function6,7 and the mechanisms enabling post-commitment noise suppression are 33 unclear. We used time-lapse imaging and mathematical modeling, and found that, after a 34 noise-driven event, human immunodeficiency virus (HIV) strongly attenuated expression 35 noise through a non-transcriptional negative-feedback circuit. Feedback is established by 36 serial generation of RNAs from post-transcriptional splicing, creating a precursor-product 37 relationship where proteins generated from spliced mRNAs auto-deplete their own 38 precursor un-spliced mRNAs. Strikingly, precursor auto-depletion overcomes the 39 theoretical limits on conventional noise suppression, minimizing noise far better than 40 transcriptional auto-repression, and dramatically stabilizes commitment to the active-41 replication state. This auto-depletion feedback motif may efficiently suppress noise in 42 other systems ranging from detained introns to non-sense mediated decay.

Transcription is an episodic process characterized by probabilistic bursts; but how these bursts are modulated by cellular physiology remains unclear and has implications for how selection may act on these fluctuations. Using simulations and single-molecule RNA counting, we examined how cellular processes influence cell-to-cell variability (noise). The results show that RNA noise is amplified in the cytoplasm compared to the nucleus in ~85% of genes across diverse promoters, genomic loci, and cell types (human and mouse). Surprisingly, measurements show further amplification of RNA noise in the cytoplasm, fitting a model of biphasic mRNA conversion between translation- and degradation-competent states. The multi-state translation-degradation of mRNA also causes substantial noise amplification in protein levels, ultimately accounting for ~74% of intrinsic protein variability in cell populations. Overall, the results demonstrate how transcriptional bursts are intrinsically amplified by mRNA processing and indicate mechanisms through which noise could act as a substrate for evolutionary selection.