Abstract Relapse remains a major challenge in the clinical management of acute myeloid leukemia (AML), and is driven by rare therapy-resistant leukemia-initiating stem cells (LSCs) that reside in specific bone marrow niches. Hypoxia signaling keeps cells in a quiescent and metabolically relaxed state, desensitizing them to chemotherapy. This suggests the hypothesis that hypoxia contributes to AML-LSC function and chemoresistance and is a therapeutic target to sensitize AML-LSCs to chemotherapy. Here, we provide a comprehensive single-cell expression atlas (119,000 cells) of AML cells and AML-LSCs in paired diagnostic-relapse samples from risk-stratified patients with AML. The HIF/hypoxia pathway is attenuated in AML-LSCs compared with differentiated AML cells, but is enhanced when compared with healthy hematopoietic cells. Accordingly, chemical inhibition cooperates with standard-of-care chemotherapy to impair leukemogenesis, substantially eliminating AML-LSCs. These findings support the HIF pathway as a stem cell regulator in human AML, and reveal avenues for combinatorial targeted and chemotherapy-based approaches to specifically eliminate AML-LSCs.

Summary Current approaches to lineage tracing of stem cell clones require genetic engineering or rely on sparse somatic DNA variants, which are difficult to capture at single-cell resolution. Here, we show that targeted single-cell measurements of DNA methylation at single-CpG resolution deliver joint information about cellular differentiation state and clonal identities. We develop EPI-clone, a droplet-based method for transgene-free lineage tracing, and apply it to study hematopoiesis, capturing hundreds of clonal trajectories across almost 100,000 single-cells. Using ground-truth genetic barcodes, we demonstrate that EPI-clone accurately identifies clonal lineages throughout hematopoietic differentiation. Applied to unperturbed hematopoiesis, we describe an overall decline of clonal complexity during murine ageing and the expansion of rare low-output stem cell clones. In aged human donors, we identified expanded hematopoietic clones with and without genetic lesions, and various degrees of clonal complexity. Taken together, EPI-clone enables accurate and transgene-free single-cell lineage tracing at scale.

Abstract Inter-patient variability and the similarity of healthy and leukemic stem cells have impeded the characterization of leukemic stem cells (LSCs) in acute myeloid leukemia (AML), and their differentiation landscape. Here, we introduce CloneTracer, a novel method that adds clonal resolution to single-cell RNA-seq datasets. Applied to samples from 19 AML patients, CloneTracer revealed routes of leukemic differentiation. While residual healthy cells dominated the dormant stem cell compartment, active leukemic stem cells resembled their healthy counterpart and retained erythroid capacity. By contrast, downstream myeloid progenitors were highly aberrant and constituted the disease-defining compartment: Their gene expression and differentiation state determined both chemotherapy response and the leukemia’s ability to differentiate to transcriptomically normal monocytes. Finally, we demonstrated the potential of CloneTracer to identify surface markers mis-regulated specifically in leukemic cells by intra-patient comparisons. Taken together, CloneTracer revealed a differentiation landscape that mimics its healthy counterpart and determines biology and therapy response in AML.

Abstract Many human cancers, including acute myeloid leukemia (AML), arise from mutations of stem and progenitor cells. Immunophenotypic profiling has shown that leukemias develop hierarchically, with mutations in leukemia stem cells associated with disease propagation and relapse 1,2 . Although leukemia initiating cells can be enriched using cell surface markers, their frequency tends to be variable and low, obscuring mechanisms and hindering effective therapies 3,4 . To define AML stem cells in human patients, we performed functional genomic profiling of diverse leukemias using label tracing techniques designed to preserve hematopoietic stem cell (HSC) function in vivo. We found that propagation of human AML is mediated by a rare but distinct quiescent label-retaining cell (LRC) population that evades detection by currently known immunophenotypic markers. We show that human AML LRC quiescence is reversible, sparing genetic clonal competition that maintains its epigenetic inheritance. LRC quiescence is defined by distinct promoter-centered chromatin and gene expression dynamics and controlled by a distinct AP-1/ETS transcription factor network, including JUN in particular, which is associated with disease persistence and chemotherapy resistance in diverse patients. These results enable prospective isolation and functional genetic manipulation of immunophenotypically-varied leukemia stem cells in human patient specimens, as well as establish key functions of epigenetic plasticity in leukemia development and therapy resistance. We anticipate that these findings will lead to the elucidation of essential properties of leukemia stem cell quiescence and the design of therapeutic strategies for their clinical identification and control.

Not available.

Abstract Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) data is widely used to study cancer cell states and their heterogeneity. However, the tumour microenvironment is usually a mixture of healthy and cancerous cells and it can be difficult to fully separate these two populations based on transcriptomics alone. If available, somatic single nucleotide variants (SNVs) observed in the scRNA-seq data could be used to identify the cancer population. However, calling somatic SNVs in scRNA-seq data is a challenging task, as most variants seen in the short read data are not somatic, but can instead be germline variants, RNA edits or transcription, sequencing or processing errors. Additionally, only variants present in actively transcribed regions for each individual cell will be seen in the data. To address these challenges, we develop CCLONE (Cancer Cell Labelling On Noisy Expression), an interpretable tool adapted to handle the uncertainty and sparsity of SNVs called from scRNA-seq data. CCLONE jointly identifies cancer clonal populations, and their associated variants. We apply CCLONE on two acute myeloid leukaemia datasets and one lung adenocarcinoma dataset and show that CCLONE captures both genetic clones and somatic events for multiple patients. These results show how CCLONE can be used to gather insight into the course of the disease and the origin of cancer cells in scRNA-seq data.

Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) data is widely used to study cancer cell states and their heterogeneity. However, the tumour microenvironment is usually a mixture of healthy and cancerous cells and it can be difficult to fully separate these two populations based on transcriptomics alone. If available, somatic single nucleotide variants (SNVs) observed in the scRNA-seq data could be used to identify the cancer population and match that information with the single cells' expression profile. However, calling somatic SNVs in scRNA-seq data is a challeng-ing task, as most variants seen in the short read data are not somatic, but can instead be germline variants, RNA edits or transcription, sequencing or processing errors. Additionally, only variants present in actively transcribed regions for each individual cell will be seen in the data.