The skin is a site of constant dialog between the immune system and commensal bacteria. However, the molecular mechanisms that allow us to tolerate the presence of skin commensals without eliciting destructive inflammation are unknown. Using a model system to study the antigen-specific response to S. epidermidis, we demonstrated that skin colonization during a defined period of neonatal life was required for establishing immune tolerance to commensal microbes. This crucial window was characterized by an abrupt influx of highly activated regulatory T (Treg) cells into neonatal skin. Selective inhibition of this Treg cell wave completely abrogated tolerance. Thus, the host-commensal relationship in the skin relied on a unique Treg cell population that mediated tolerance to bacterial antigens during a defined developmental window. This suggests that the cutaneous microbiome composition in neonatal life is crucial in shaping adaptive immune responses to commensals, and disrupting these interactions might have enduring health implications.

Summary Mechanistic understanding of the impacts of the gut microbiota on human health has been hampered by limited throughput in animal models. To enable systematic interrogation of gut-relevant microbial communities, here we generated hundreds of in vitro communities cultured from diverse stool samples in various media. Species composition revealed stool-derived communities that are phylogenetically complex, diverse, stable, and highly reproducible. Community membership depended on both medium and initial inoculum, with certain media preserving inoculum compositions. Different inocula yielded different community compositions, indicating their potential for personalized therapeutics. Communities were robust to freezing and large-volume culturing, enabling future translational applications. Defined communities were generated from isolates and reconstituted growth and composition similar to those of communities derived from stool inocula. Finally, in vitro experiments probing the response to ciprofloxacin successfully predicted many changes observed in vivo , including the resilience and sensitivity of each Bacteroides species. Thus, stool-derived in vitro communities constitute a powerful resource for microbiota research.

Summary Due to limitations on high-resolution strain tracking, selection dynamics during gut-microbiota colonization and transmission between hosts remain mostly mysterious. Here, we introduced hundreds of barcoded Escherichia coli strains into germ-free mice and quantified strain-level dynamics and metagenomic changes. Mutants involved in motility and utilization of abundant metabolites were reproducibly selected within days. Even with rapid selection, coprophagy enforced similar barcode distributions across co-housed mice. Whole-genome sequencing of hundreds of isolates quantified evolutionary dynamics and revealed linked alleles. A population-genetics model predicted substantial fitness advantages for certain mutants and that migration accounted for ~10% of the resident microbiota each day. Treatment with ciprofloxacin demonstrated the interplay between selection and transmission. While initial colonization was mostly uniform, in two mice a bottleneck reduced diversity and selected for ciprofloxacin resistance in the absence of drug. These findings highlight the interplay between environmental transmission and rapid, deterministic selection during evolution of the intestinal microbiota.

Summary Lymphocytes in barrier tissues play critical roles in host defense and homeostasis. These cells take up residence in tissues during defined developmental windows, when they may demonstrate distinct phenotypes and functions. Here, we utilized mass and flow cytometry to elucidate early features of human skin immunity, demonstrating a unique fetal skin lymphocyte signature. While most conventional αβ T (Tconv) cells in fetal skin have a naïve, proliferative phenotype, a subset of CD4 + Tconv and CD8 + cells demonstrate memory-like features and a propensity for IFNγ production. Skin regulatory T cells dynamically accumulate over the second trimester in temporal and regional association with hair follicle development. These fetal skin Tregs demonstrate an effector memory phenotype while differing from their adult counterparts in expression of key effector molecules. Thus, we identify features of prenatal skin lymphocytes that may have key implications for understanding antigen and allergen encounters in utero and in infancy.

Abstract Genomic analyses have revealed how the gut microbiota impacts human health. However, knowledge about the physiology of most gut commensals is largely lacking. Here, we sorted cells from a pooled library to construct an ordered collection of transposon-insertion mutants in the model commensal Bacteroides thetaiotaomicron . We applied a pooling strategy with barcode sequencing to locate mutants and created a condensed collection with single insertions in 2,565 genes. This effort enabled the development of an accurate model for progenitor-collection assembly, which identified strain-abundance biases and multi-insertion strains as important factors that limit coverage. To demonstrate the potential for phenotypic screening, we analyzed growth dynamics and morphology of the condensed collection and identified growth defects and altered cell shape in the sphingolipid-synthesis gene BT0870 and the thiamine scavenging gene BT2397. Analyses of this collection and utilization of the platform described herein to construct future ordered libraries will increase understanding of gut commensal physiology and colonization strategies.

Summary Gut bacteria rapidly evolve in vivo , but their long-term success requires dispersal across hosts. Here, we quantify this interplay by tracking >50,000 genomically barcoded lineages of the prevalent commensal Bacteroides thetaiotaomicron ( Bt ) among co-housed mice. We find that adaptive mutations rapidly spread between hosts, overcoming the natural colonization resistance of resident Bt strains. Daily transmission rates varied >10-fold across hosts, but shared selection pressures drove predictable engraftment of specific lineages over time. The addition of a 49-species community shifted the adaptive landscape relative to mono-colonized Bt without slowing the rate of evolution, and reduced transmission while still allowing specific mutants to engraft. Whole-genome sequencing uncovered diverse modes of adaptation involving complex carbohydrate metabolism. Complementary in vitro evolution across 29 carbon sources revealed variable overlap with in vivo selection pressures, potentially reflecting synergistic and antagonistic pleiotropies. These results show how high-resolution lineage tracking enables quantification of commensal evolution across ecological scales.