Several vaccines have been introduced to combat the coronavirus infectious disease-2019 (COVID-19) pandemic, caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Current SARS-CoV-2 vaccines include mRNA-containing lipid nanoparticles or adenoviral vectors that encode the SARS-CoV-2 Spike (S) protein of SARS-CoV-2, inactivated virus, or protein subunits. Despite growing success in worldwide vaccination efforts, additional capabilities may be needed in the future to address issues such as stability and storage requirements, need for vaccine boosters, desirability of different routes of administration, and emergence of SARS-CoV-2 variants such as the Delta variant. Here, we present a novel, well-characterized SARS-CoV-2 vaccine candidate based on extracellular vesicles (EVs) of Salmonella typhimurium that are decorated with the mammalian cell culture-derived Spike receptor-binding domain (RBD). RBD-conjugated outer membrane vesicles (RBD-OMVs) were used to immunize the golden Syrian hamster ( Mesocricetus auratus ) model of COVID-19. Intranasal immunization resulted in high titers of blood anti-RBD IgG as well as detectable mucosal responses. Neutralizing antibody activity against wild-type and Delta variants was evident in all vaccinated subjects. Upon challenge with live virus, hamsters immunized with RBD-OMV, but not animals immunized with unconjugated OMVs or a vehicle control, avoided body mass loss, had lower virus titers in bronchoalveolar lavage fluid, and experienced less severe lung pathology. Our results emphasize the value and versatility of OMV-based vaccine approaches.

ABSTRACT We compared four orthogonal technologies for sizing, counting, and phenotyping of extracellular vesicles (EVs) and synthetic particles. The platforms were: single-particle interferometric reflectance imaging sensing (SP-IRIS) with fluorescence, nanoparticle tracking analysis (NTA) with fluorescence, microfluidic resistive pulse sensing (MRPS), and nanoflow cytometry measurement (NFCM). EVs from the human T lymphocyte line H9 (high CD81, low CD63) and the promonocytic line U937 (low CD81, high CD63) were separated from culture conditioned medium (CCM) by differential ultracentrifugation (dUC) or a combination of ultrafiltration (UF) and size exclusion chromatography (SEC) and characterized by transmission electron microscopy (TEM) and Western blot (WB). Mixtures of synthetic particles (silica and polystyrene spheres) with known sizes and/or concentrations were also tested. MRPS and NFCM returned similar particle counts, while NTA detected counts approximately one order of magnitude lower for EVs, but not for synthetic particles. SP-IRIS events could not be used to estimate particle concentrations. For sizing, SP-IRIS, MRPS, and NFCM returned similar size profiles, with smaller sizes predominating (per power law distribution), but with sensitivity typically dropping off below diameters of 60 nm. NTA detected a population of particles with a mode diameter greater than 100 nm. Additionally, SP-IRIS, MRPS, and NFCM were able to identify at least three of four distinct size populations in a mixture of silica or polystyrene nanoparticles. Finally, for tetraspanin phenotyping, the SP-IRIS platform in fluorescence mode was able to detect at least two markers on the same particle, while NFCM detected either CD81 or CD63. Based on the results of this study, we can draw conclusions about existing single-particle analysis capabilities that may be useful for EV biomarker development and mechanistic studies.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) have great potential as novel drug carriers for the treatment of various diseases. These lipid bilayer vesicles are naturally abundant in mammalian tissues and circulation, can be loaded with therapeutic small molecule drugs, (si)RNA, proteins and CRISPR/Cas9, and may be engineered for retention by specific tissues. However, many questions remain on the optimal dosing, administration route, and pharmacokinetics of EVs. Previous studies have addressed biodistribution and pharmacokinetics in rodents, but little evidence is available from larger animals. Here, we investigated the pharmacokinetics and biodistribution of Expi293F-derived EVs labelled with a highly sensitive nanoluciferase reporter (palmGRET) in a non-human primate model (Macaca nemestrina), comparing intravenous (IV) and intranasal (IN) administration over a 125-fold dose range. We report that EVs administered IV had markedly longer circulation times in plasma than previously reported in mice, and were detectable in cerebrospinal fluid (CSF) after 30-60 minutes. Already after one minute following IV administration, we observed EV uptake by PBMCs, most notably B-cells. EVs were detected in liver and spleen within one hour of IV administration. None of the IN doses resulted in readily detectable EV levels in plasma, CSF, or organs, suggesting that IN delivery of EVs in large animals including humans may require reconsideration or pretreatment approaches. Furthermore, EV circulation times strongly decreased after repeated IV administration, possibly due to immune responses and with clear implications for xenogeneic EV-based therapeutics. We hope that our findings from this baseline study in macaques will help to inform future research and therapeutic development of EVs.

ABSTRACT Hypoxia, or low oxygen tension, is frequently found in highly proliferative solid tumors such as anaplastic thyroid carcinoma (ATC) and is believed to promote resistance to chemotherapy and radiation. Identifying hypoxic cells for targeted therapy may thus be an effective approach to treating aggressive cancers. Here, we explore the potential of the well-known hypoxia-responsive microRNA (miRNA) miR-210-3p as a cellular and extracellular biological marker of hypoxia. We compare miRNA expression across several ATC and papillary thyroid cancer (PTC) cell lines. In the ATC cell line SW1736, miR-210-3p expression levels indicate hypoxia during exposure to low oxygen conditions (2% O 2 ). Furthermore, when released by SW1736 cells into the extracellular space, miR-210-3p is associated with RNA carriers such as extracellular vesicles (EVs) and Argonaute-2 (AGO2), making it a potential extracellular marker for hypoxia.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) can be loaded with therapeutic cargo and engineered for retention by specific body sites; therefore, they have great potential for targeted delivery of biomolecules to treat diseases. However, the pharmacokinetics and biodistribution of EVs in large animals remain relatively unknown, especially in primates. We recently reported that when cell culture-derived EVs are administered intravenously to Macaca nemestrina (pig-tailed macaques), they differentially associate with specific subsets of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). More than 60% of CD20 + B cells were observed to associate with EVs for up to 1 hr post-intravenous administration. To investigate these associations further, we developed an ex vivo model of whole blood collected from healthy pig-tailed macaques. Using this ex vivo system, we found that labeled EVs preferentially associate with B cells in whole blood at levels similar to those detected in vivo . This study demonstrates that ex vivo blood can be used to study EV-blood cell interactions.

Objective: evaluate 1) if targeting of platinum nagnetic nanoclusters will promote uptake in osteosarcoma cells in vitro, 2) targeting will improve uptake and delivery in murine OSA in vivo compared to free carboplatin, 3) incorporation into a sustained release carrier (SRC) will prolong local retention in vivo. Methods: Complex stability and peptide loading was assessed. Drug release was tested at pH 7.4 and 5.5 and cellular uptake and cytotoxity determined for canine, human and mouse osteosarcoma. Subcutaneous murine osteosarcoma was induced and optimal dose and time until tumor growth were established. Tumor bearing mice were equally distributed between 8 treatment (0.5mg carboplatin/mouse) and 1 control group and sacrificed at 8 predetermined time points between 1 hour and 8 days. Blood, tumor site and organs were harvested for tissue ferron and platinum content analysis (ICP-MS). Results: Carboplatin was preferentially released at pH5.5. Targeting increased cellular uptake for carboplatin 15.2-fold, and decreased IC50 at 24h and 48h. At 2 weeks, a SC injection of 1-1.56 live cells/mouse reliably resulted in a palpable tumor. Plasma platinum peaked prior to 6 hours while plasma ferron peaked at 24-48 hours. Intratumoral delivery did not lead to a sustained local presence while local delivery in a SRC after surgery did. Conclusions: Targeting of MNC-carboplatin fis possible with an increased osteosarcoma cell uptake in vitro. In vivo metastatic uptake could not be assessed due to lack of metastases, but local delivery in a SRC yielded high local, and low systemic platinum concentrations in mice.

Abstract High‐sensitivity flow cytometers have been developed for multi‐parameter characterization of single extracellular vesicles (EVs), but performance varies among instruments and calibration methods. Here we compare the characterization of identical (split) EV samples derived from human colorectal cancer (DiFi) cells by three high‐sensitivity flow cytometers, two commercial instruments, CytoFLEX/CellStream, and a custom single‐molecule flow cytometer (SMFC). DiFi EVs were stained with the membrane dye di‐8‐ANEPPS and with PE‐conjugated anti‐EGFR or anti‐tetraspanin (CD9/CD63/CD81) antibodies for estimation of EV size and surface protein copy numbers. The limits of detection (LODs) for immunofluorescence and vesicle size based on calibration using cross‐calibrated, hard‐dyed beads were ∼10 PE/∼80 nm EV diameter for CytoFLEX and ∼10 PEs/∼67 nm for CellStream. For the SMFC, the LOD for immunofluorescence was 1 PE and ≤ 35 nm for size. The population of EVs detected by each system (di‐8‐ANEPPS + /PE + particles) differed widely depending on the LOD of the system; for example, CellStream/CytoFLEX detected only 5.7% and 1.5% of the tetraspanin‐labelled EVs detected by SMFC, respectively, and median EV diameter and antibody copy numbers were much larger for CellStream/CytoFLEX than for SMFC as measured and validated using super‐resolution/single‐molecule TIRF microscopy. To obtain a dataset representing a common EV population analysed by all three platforms, we filtered out SMFC and CellStream measurements for EVs below the CytoFLEX LODs as determined by bead calibration (10 PE/80 nm). The inter‐platform agreement using this filtered dataset was significantly better than for the unfiltered dataset, but even better concordance between results was obtained by applying higher cutoffs (21 PE/120 nm) determined by threshold analysis using the SMFC data. The results demonstrate the impact of specifying LODs to define the EV population analysed on inter‐instrument reproducibility in EV flow cytometry studies, and the utility of threshold analysis of SMFC data for providing semi‐quantitative LOD values for other flow cytometers.

Abstract Interest in using nanoparticles for delivery of therapeutic RNA has been steadily growing, provoking a need to precisely understand their structure and contents. Single-particle and single-molecule analysis techniques provide snapshots of single biological nanoparticles, including viruses, liposomes, and extracellular vesicles (EVs). While existing methods primarily focus on protein detection, RNA delivery is becoming increasingly prevalent. A method to simultaneously detect protein and internal RNA in the same particle would reveal variability in size, structure, and RNA packaging efficiency, enabling optimization of nanoparticle delivery. Here, we introduce SPIRFISH, a high-throughput method for single-particle protein and RNA analysis, combining single particle interferometric reflectance imaging sensor (SP-IRIS) with single-molecule fluorescence in-situ hybridization (smFISH). Using SPIRFISH, we detect HIV-1 envelope protein and genomic RNA within single infectious virions, allowing resolution against EV background and noninfectious virions. We further show that SPIRFISH can be used to detect specific RNA within EVs. SPIRFISH should enable single particle analysis of a broad class of RNA-containing nanoparticles. Teaser: A new single particle analysis technique simultaneously detects specific RNA and protein in biological nanoparticles.