Abstract Avian influenza virus (AIV) currently causes a panzootic with extensive mortality in wild birds, poultry, and wild mammals, thus posing a major threat to global health and underscoring the need for efficient monitoring of its distribution and evolution. Here, we utilized a well-defined AIV strain to systematically investigate AIV characterization through rapid, portable nanopore sequencing by (i) benchmarking the performance of fully portable RNA extraction and viral detection; (ii) comparing the latest DNA and RNA nanopore sequencing approaches for in-depth AIV profiling; and (iii) evaluating the performance of various computational pipelines for viral consensus sequence creation and phylogenetic analysis. Our results show that the latest RNA-specific nanopores can accurately genomically profile AIV from native RNA while additionally detecting RNA epigenetic modifications. We further identified an optimal laboratory and bioinformatic pipeline for reconstructing viral consensus genomes from nanopore sequencing data at various rarefaction thresholds, which we validated by application to real-world environmental samples for AIV monitoring in livestock. Author Summary We tested portable, rapid, and easy-to-use technology to obtain more information about the potentially zoonotic RNA virus avian influenza virus, or AIV. AIV has spread globally via the migratory paths of wild birds, and endangers domestic birds, mammals, and human populations given past evidence of infections of different animal species. We here used novel genomic technology that is based on nanopores to explore the genomes of the virus; we established optimized ways of creating the viral genome by comparing different laboratory and computational approaches and the performance of nanopores that either sequence the viral RNA directly or the converted DNA. We then applied the optimized protocol to dust samples which were collected from a duck farm in France during an AIV outbreak. We showed that we were able to use the resulting data to reconstruct the relationship between the virus responsible for the outbreak and previously detected AIV. Altogether, we showed how novel easy-to-use genomic technology can support the surveillance of potentially zoonotic pathogens by accurately recreating the viral genomes to better understand evolution and transmission of these pathogens.

Abstract The ability to differentiate between viable and dead microorganisms in metagenomic samples is crucial for various microbial inferences, ranging from assessing ecosystem functions of environmental microbiomes to inferring the virulence of potential pathogens. While established viability-resolved metagenomic approaches are labor-intensive as well as biased and lacking in sensitivity, we here introduce a new fully computational framework that leverages nanopore sequencing technology to assess microbial viability directly from freely available nanopore signal data. Our approach utilizes deep neural networks to learn features from such raw nanopore signal data that can distinguish DNA from viable and dead microorganisms in a controlled experimental setting. The application of explainable AI tools then allows us to robustly pinpoint the signal patterns in the nanopore raw data that allow the model to make viability predictions at high accuracy. Using the model predictions as well as efficient explainable AI-based rules, we show that our framework can be leveraged in a real-world application to estimate the viability of pathogenic Chlamydia , where traditional culture-based methods suffer from inherently high false negative rates. This application shows that our viability model captures predictive patterns in the nanopore signal that can in principle be utilized to predict viability across taxonomic boundaries and indendent of the killing method used to induce bacterial cell death. While the generalizability of our computational framework needs to be assessed in more detail, we here demonstrate for the first time the potential of analyzing freely available nanopore signal data to infer the viability of microorganisms, with many applications in environmental, veterinary, and clinical settings. Author summary Metagenomics investigates the entirety of DNA isolated from an environment or a sample to holistically understand microbial diversity in terms of known and newly discovered microorganisms and their ecosystem functions. Unlike traditional culturing of microorganisms, metagenomics is not able to differentiate between viable and dead microorganisms since DNA might readily persist under different environmental circumstances. The viability of microorganisms is, however, of importance when making inferences about a microorganism’s metabolic potential, a pathogen’s virulence, or an entire microbiome’s impact on its environment. As existing viability-resolved metagenomic approaches are labor-intensive, expensive, and lack sensitivity, we here investigate our hypothesis if freely available nanopore sequencing signal data, which captures DNA molecule information beyond the DNA sequence, might be leveraged to infer such viability. This hypothesis assumes that DNA from dead microorganisms accumulates certain damage signatures that reflect microbial viability and can be read from nanopore signal data using fully computational frameworks. We here show first evidence that such a computational framework might be feasible by training a deep model on controlled experimental data to predict viability at high accuracy, exploring what the model has learned, and applying it to an independent real-world dataset of an infectious pathogen. While the generalizability of this computational framework needs to be assessed in much more detail, we demonstrate that freely available data might be usable for relevant viability inferences in environmental, veterinary, and clinical settings.

While the air microbiome and its diversity are known to be essential for human health and ecosystem resilience, the current lack of holistic air microbial diversity monitoring means that little is known about the air microbiome's composition, distribution, or functional effects. We here show that nanopore shotgun sequencing can robustly assess the air microbiome in combination with active air sampling through liquid impingement and tailored computational analysis. We provide laboratory and computational protocols for air microbiome profiling, and reliably assess the taxonomic composition of the core air microbiome in controlled and natural environments. Based on de novo assemblies from the long sequencing reads, we further identify the taxa of several air microbiota down to the species level and annotate their ecosystem functions, including their potential role in natural biodegradation processes. As air monitoring by nanopore sequencing can be employed in an automatable, fast, and portable manner for in situ applications all around the world, we envision that this approach can help holistically explore the role of the air microbiome.

Abstract Real-time genomics through nanopore sequencing holds the promise of fast antibiotic resistance prediction directly in the clinical setting. However, concerns about the accuracy of genomics-based resistance predictions persist, particularly when compared to traditional, clinically established diagnostic methods. Here, we leverage the case of a multi-drug resistant Klebsiella pneumoniae infection to demonstrate how real-time genomics can enhance the accuracy of antibiotic resistance profiling in complex infection scenarios. Our results show that unlike established diagnostics, nanopore sequencing data analysis can accurately detect low-abundance plasmid-mediated resistance, which often remains undetected by conventional methods. This capability has direct implications for clinical practice, where such “hidden” resistance profiles can critically influence treatment decisions. Consequently, the rapid, in situ application of real-time genomics holds significant promise for improving clinical decision-making and patient outcomes.

Abstract While the air microbiome and its diversity are essential for human health and ecosystem resilience, comprehensive air microbial diversity monitoring has remained rare, so that little is known about the air microbiome’s composition, distribution, or functionality. Here we show that nanopore sequencing-based metagenomics can robustly assess the air microbiome in combination with active air sampling through liquid impingement and tailored computational analysis. We provide fast and portable laboratory and computational approaches for air microbiome profiling, which we leverage to robustly assess the taxonomic composition of the core air microbiome of a controlled greenhouse environment and of a natural outdoor environment. We show that long-read sequencing can resolve species-level annotations and specific ecosystem functions through de novo metagenomic assemblies despite the low amount of fragmented DNA used as an input for nanopore sequencing. We then apply our pipeline to assess the diversity and variability of an urban air microbiome, using Barcelona, Spain, as an example; this randomized experiment gives first insights into the presence of highly stable location-specific air microbiomes within the city’s boundaries, and showcases the robust microbial assessments that can be achieved through automatable, fast, and portable nanopore sequencing technology.