The release of peptide hormones is predominantly regulated by a transient increase in cytosolic Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] c ). To trigger exocytosis, Ca 2+ ions enter the cytosol from intracellular Ca 2+ stores or from the extracellular space. The molecular events of late stages of exocytosis, and their dependence on [Ca 2+ ] c , were extensively described in isolated single cells from various endocrine glands. Notably less work has been done on endocrine cells in situ to address the heterogeneity of [Ca 2+ ] c events contributing to a collective functional response of a gland. For this beta cell collectives in a pancreatic islet are particularly well suited as they are the smallest, experimentally manageable functional unit, where [Ca 2+ ] c dynamics can be simultaneously assessed on both cellular and collective level. Here we measured [Ca 2+ ] c transients across all relevant timescales, from a sub-second to a minute time range, using high-resolution imaging with low-affinity Ca 2+ sensor. We quantified the recordings with a novel computational framework for semi-automatic image segmentation and [Ca 2+ ] c event identification. Our results demonstrate that under physiological conditions the duration of [Ca 2+ ] c events is variable, and segregated into 3 reproducible modes, sub-second, second and tens of seconds time range, and are a result of a progressive temporal summation of the shortest events. Using pharmacological tools we show that activation of intracellular Ca 2+ receptors is both sufficient and necessary for glucose-dependent [Ca 2+ ] c oscillations in beta cell collectives, and that a subset of [Ca 2+ ] c events could be triggered even in the absence of Ca 2+ influx across the plasma membrane. In aggregate, our experimental and analytical platform was able to readily address the involvement of intracellular Ca 2+ receptors in shaping the heterogeneity of [Ca 2+ ] c responses in collectives of endocrine cells in situ.

Abstract Insulin receptor (Insr) protein can be found at higher levels in pancreatic β-cells than in most other tissues, but the consequences of β-cell insulin resistance remain enigmatic. Ins1 cre allele was used to delete Insr specifically in β-cells of both female and male mice. Experimental mice were compared to Ins1 cre -containing littermate controls at multiple ages and on multiple diets. RNA-seq of purified recombined β-cells revealed transcriptomic consequences of Insr loss, which differed between female and male mice. Action potential and calcium oscillation frequencies were increased in Insr knockout β- cells from female, but not male mice, whereas only male β Insr KO mice had reduced ATP-coupled oxygen consumption rate and reduced expression of genes involved in ATP synthesis. Female β Insr KO and β Insr HET mice exhibited elevated insulin release in perifusion experiments, during hyperglycemic clamps, and following i.p. glucose challenge. Deletion of Insr did not alter β-cell area up to 9 months of age, nor did it impair hyperglycemia-induced proliferation. Based on our data, we adapted a mathematical model to include β-cell insulin resistance, which predicted that β-cell Insr knockout would improve glucose tolerance depending on the degree of whole-body insulin resistance. Indeed, glucose tolerance was significantly improved in female β Insr KO and β Insr HET mice when compared to controls at 9, 21 and 39 weeks, and also in insulin-sensitive 4-week old males. We did not observe improved glucose tolerance in older male mice or in high fat diet-fed mice, corroborating the prediction that global insulin resistance obscures the effects of β-cell specific insulin resistance. The propensity for hyperinsulinemia was associated with mildly reduced fasting glucose and increased body weight. We further validated our main in vivo findings using the Ins1 -CreERT transgenic line and found that male mice had improved glucose tolerance 4 weeks after tamoxifen-mediated Insr deletion. Collectively, our data show that loss of β-cell Insr contributes to glucose-induced hyperinsulinemia, thereby improving glucose homeostasis in otherwise insulin sensitive dietary and age contexts.

Abstract Hyperinsulinemia is commonly viewed as a compensatory response to insulin resistance, yet studies have suggested that chronically elevated insulin may also drive insulin resistance. The molecular mechanisms underpinning this potentially cyclic process remain poorly defined, especially on a transcriptome-wide level. To study the direct effects of prolonged exposure to excess insulin in muscle cells, we incubated C2C12 myotubes with elevated insulin for 16 hours, followed by 6 hours of serum starvation, and established that acute AKT and ERK signaling were attenuated in this model of in vitro hyperinsulinemia. Global RNA-sequencing of cells both before and after nutrient withdrawal highlighted genes in the insulin signaling, FOXO signaling, and glucose metabolism pathways indicative of ‘hyperinsulinemia’ and ‘starvation’ programs. We observed that hyperinsulinemia led to a substantial reduction in insulin receptor ( Insr) gene expression, and subsequently a reduced surface INSR and total INSR protein, both in vitro and in vivo . Transcriptomic meta-analysis in >450 human samples demonstrated that fasting insulin reliably and negatively correlated with insulin receptor ( INSR ) mRNA in skeletal muscle. Bioinformatic modeling combined with RNAi, identified SIN3A as a negative regulator of Insr mRNA (and JUND, MAX, and MXI as positive regulators of Irs2 mRNA). Together, our analysis identifies novel mechanisms which may explain the cyclic processes underlying hyperinsulinemia-induced insulin resistance in muscle, a process directly relevant to the etiology and disease progression of type 2 diabetes.

Summary The rising pancreatic cancer incidence due to obesity and type 2 diabetes is closely tied to hyperinsulinemia, an independent cancer risk factor. Previous studies demonstrated reducing insulin production suppressed pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) pre-cancerous lesions in Kras -mutant mice. However, the pathophysiological and molecular mechanisms remained unknown and in particular it was unclear whether hyperinsulinemia affected PanIN precursor cells directly or indirectly. Here, we demonstrate that insulin receptors ( Insr ) in Kras G12D -expressing pancreatic acinar cells are dispensable for glucose homeostasis, but necessary for hyperinsulinemia-driven PanIN formation in the context of diet-induced hyperinsulinemia and obesity. Mechanistically, this was attributed to amplified digestive enzyme protein translation, triggering of local inflammation and PanIN metaplasia in vivo . In vitro , insulin dose-dependently increased acinar-to-ductal metaplasia formation in a trypsin– and Insr -dependent manner. Collectively, our data shed light on the mechanisms connecting obesity-driven hyperinsulinemia and pancreatic cancer development.

ABSTRACT Objective Pancreatic β cells play a key role in glucose homeostasis; dysfunction of this critical cell type causes type 2 diabetes (T2D). Emerging evidence points to sex differences in β cells, but few studies have examined male-female differences in β cell stress responses and resilience across multiple contexts, including diabetes. Here, we address the need for high-quality information on sex differences in β cell/islet gene expression and function using both human and rodent samples. Methods We compared β cell gene expression and insulin secretion in donors living with T2D to non-diabetic donors in both males and females. In mice, we generated a well-powered islet RNAseq dataset from 20-week-old male and female siblings with equivalent insulin sensitivity. Because on our unbiased analysis of gene expression pointed to sex differences in endoplasmic reticulum (ER) stress response, we subjected islets isolated from age-matched male and female mice to thapsigargin treatment and monitored protein synthesis, cell death, and β cell insulin production and secretion. Transcriptomic and proteomic analyses were used to characterize sex differences in islet responses to ER stress. Results Our single-cell analysis of human β cells revealed sex-specific changes to gene expression and function in T2D, correlating with more robust insulin secretion in islets isolated from female donors living with T2D compared to male T2D donors. In mice, RNA sequencing revealed differential enrichment of unfolded protein response pathway-associated genes, where female islets showed higher expression of genes linked with protein synthesis, folding, and processing. This differential expression was biologically significant, as female islets were more resilient to ER stress induction with thapsigargin. Specifically, female islets maintained better insulin secretion and showed a distinct transcriptional response under ER stress compared with males. Conclusions Our data demonstrate that physiologically significant sex differences in β cell gene expression exist in both humans and mice, and that female β cells maintain better insulin production and secretion across multiple physiological and pathological contexts.

ABSTRACT Type 1 diabetes is characterized by the autoimmune destruction of insulin secreting β cells. Genetic variations upstream at the insulin ( INS ) locus contribute to ~10% of type 1 diabetes heritable risk. Multiple studies showed an association between rs3842753 C/C genotype and type 1 diabetes susceptibility, but the molecular mechanisms remain unclear. To date, no large-scale studies have looked at the effect of genetic variation at rs3842753 on INS mRNA at the single cell level. We aligned all human islet single cell RNA sequencing datasets available to us in 2020 to the reference genome GRCh38.98 and genotyped rs3842753, integrating 2315 β cells and 1223 β-like cells from 13 A/A protected donors, 23 A/C heterozygous donors, and 35 C/C at-risk donors, including adults without diabetes and with type 2 diabetes. INS expression mean and variance were significantly higher in single β cells from females compared with males. Comparing across β cells and β-like cells, we found that rs3842753 C containing cells (either homozygous or heterozygous) had the highest INS expression. We also found that β cells with the rs3842753 C allele had significantly higher ER stress marker gene expression compared to the A/A homozygous genotype. These findings support the emerging concept that inherited risk of type 1 diabetes may be associated with inborn, persistent elevated insulin production which may lead to β cell ER stress and fragility.

Abstract A central goal of physiological research is the understanding of cell-specific roles of disease-associated genes. Cre-mediated recombineering is the tool of choice for cell type-specific analysis of gene function in pre-clinical models. In the type 1 diabetes research field, multiple lines of NOD mice have been engineered to express Cre recombinase in pancreatic β-cells using insulin promoter fragments, but tissue promiscuity remains a concern. Constitutive Ins1 tm1.1(cre)Thor ( Ins1 Cre ) mice on the C57/bl6-J background has high β-cell specificity and with no reported off-target effects. We explored if NOD: Ins1 Cre mice could be used to investigate β-cell gene deletion in type 1 diabetes disease modeling. We studied wildtype ( Ins1 WT/WT ), Ins1 heterozygous ( Ins1 Cre/WT or Ins1 Neo/WT ), and Ins1 null ( Ins1 Cre/Neo ) littermates on a NOD background. Female Ins1 Neo/WT mice exhibited significant protection from diabetes, with further near-complete protection in Ins1 Cre/WT mice. The effects of combined neomycin and Cre knock-in in Ins1 Neo/Cre mice were not additive to the Cre knock-in alone. In Ins1 Neo/Cre mice, protection from diabetes was associated with reduced insulitis at 12 weeks of age. Collectively, these data confirm previous reports that loss of Ins1 alleles protects NOD mice from diabetes development and demonstrates, for the first time, that Cre itself may have additional protective effects. This has significant implications for the experimental design and interpretation of pre-clinical type 1 diabetes studies using β-cell-specific Cre in NOD mice.

ABSTRACT Genetic factors affect an individual’s risk of developing obesity, but in most cases each genetic variant has a small effect. Discovery of genes that regulate obesity may provide clues about its underlying biological processes and point to new ways the disease can be treated. Pre-clinical animal models facilitate genetic discovery in obesity because environmental factors can be better controlled compared to the human population. We studied inbred mouse strains to identify novel genes affecting obesity and glucose metabolism. BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR) mice are fatter and more glucose intolerant than C57BL/6J (B6) mice. Prior genetic studies of these strains identified an obesity locus on chromosome 2. Using congenic mice, we found that obesity was affected by a ~316 kb region, with only two known genes, pyruvate dehydrogenase kinase 1 (Pdk1) and integrin alpha 6 (Itga6). Both genes had mutations affecting their amino acid sequence and reducing mRNA levels. Both genes have known functions that could modulate obesity, lipid metabolism, insulin secretion and/or glucose homeostasis. We hypothesized that genetic variation in or near Pdk1 or Itga6 causing reduced Pdk1 and Itga6 expression would promote obesity and impaired glucose tolerance. We used knockout mice lacking Pdk1 or Itga6 fed an obesigenic diet to test this hypothesis. Under the conditions we studied, we were unable to detect an individual contribution of either Pdk1 or Itga6 to body weight. However, we identified a previously unknown role for Pdk1 in cardiac lipid metabolism providing the basis for future investigations in that area.

Abstract Context The incidence of new onset diabetes after transplant (NODAT) has increased over the past decade, likely due to calcineurin inhibitor-based immunosuppressants, including tacrolimus (TAC) and cyclosporin (CsA). Voclosporin (VCS), a next generation calcineurin inhibitor is reported to cause fewer incidences of NODAT but the reason is unclear. Objective Whilst calcineurin signaling plays important roles in pancreatic β-cell survival, proliferation, and function, its effects on human β-cells remain understudied. In particular, we do not understand why some calcineurin inhibitors have more profound effects on the incidence of NODAT. Methods We compared the effects of TAC and VCS on the dynamics of insulin secretory function, programmed cell death rate, and the transcriptomic profile of human islets. We studied two clinically relevant doses of TAC (10 ng/ml, 30 ng/ml) and VCS (20 ng/ml, 60 ng/ml), meant to approximate the clinical trough and peak concentrations. Results TAC, but not VCS, caused a significant impairment of 15 mM glucose-stimulated and 30 mM KCl-stimulated insulin secretion. This points to molecular defects in the distal stages of exocytosis after voltage-gated Ca 2+ entry. No significant effects on islet cell survival or total insulin content were identified. RNA sequencing showed that TAC significantly decreased the expression of 17 genes, including direct and indirect regulators of exocytosis ( SYT16 , TBC1D30 , PCK1 , SMOC1 , SYT5, PDK4 , and CREM ), whereas VCS has less broad and milder effects on gene expression. Conclusions Clinically relevant doses of TAC, but not VCS, directly inhibit insulin secretion from human islets, likely via transcriptional control of exocytosis machinery.

Abstract Hyperinsulinemia is independently associated with increased risk and mortality of pancreatic cancer. We recently reported that a ∼50% reduction in pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) pre-cancerous lesions in mice could be achieved with reduced insulin production. However, only female mice remained normoglycemic and only the gene dosage of rodent-specific Ins1 alleles was tested in our previous model. Moreover, we did not delve into the molecular and cellular mechanisms associated with modulating hyperinsulinemia. Here, we studied PanIN lesion development in both male and female Ptf1a CreER ; Kras LSL-G12D mice lacking the rodent specific Ins1 gene, and possessing one or two alleles of the wild-type Ins2 gene to modulate insulin production. High-fat diet induced hyperinsulinemia was transiently and modestly reduced, without affecting glucose tolerance, in male and female mice with only one allele of Ins2 . Genetic reduction of insulin production resulted in mice with a tendency for less PanIN and acinar-to-ductal metaplasia (ADM) lesions. Using single-cell transcriptomics, we found hyperinsulinemia affected multiple cell types in the pancreas, with the most statistically significant effects on local immune cell populations, which were highly represented in our analysis. Specifically, hyperinsulinemia modulated pathways associated with protein translation, MAPK-ERK signaling, and PI3K-AKT signaling, which were changed in epithelial cells and subsets of immune cells. These data suggest a role for the immune microenvironment in hyperinsulinemia-driven PanIN development. Together with our previous work, we propose that mild suppression of insulin levels may be useful in preventing pancreatic cancer by acting on multiple cell types.