The M protein of coronavirus plays a central role in virus assembly, turning cellular membranes into workshops where virus and host factors come together to make new virus particles. We investigated how M structure and organization is related to virus shape and size using cryo-electron microscopy, tomography and statistical analysis. We present evidence that suggests M can adopt two conformations and that membrane curvature is regulated by one M conformer. Elongated M protein is associated with rigidity, clusters of spikes and a relatively narrow range of membrane curvature. In contrast, compact M protein is associated with flexibility and low spike density. Analysis of several types of virus-like particles and virions revealed that S protein, N protein and genomic RNA each help to regulate virion size and variation, presumably through interactions with M. These findings provide insight into how M protein functions to promote virus assembly.

Recent observations of charged colloidal particles trapped at the air-water interface revealed long-range interparticle attractive forces, not accounted for by the standard theories of colloidal interactions. We propose a mechanism for attraction which is based on nonuniform wetting causing an irregular shape of the particle meniscus. The excess water surface area created by these distortions can be minimized when two adjacent particles assume an optimum relative orientation and distance. Typically, for spheres with diameter of 1 &mgr;m at an interparticle distance of 2 &mgr;m, deviations from the ideal contact line by as little as 50 nm result in an interaction energy of the order of 10(4)kT. Roughness-induced capillarity explains the experimental findings, including the cluster dissolution caused by addition of detergent to the subphase and the formation of linear aggregates. This kind of interaction should also be of importance in particle-stabilized foams and emulsions.

Synucleins and apolipoproteins have been implicated in a number of membrane and lipid trafficking events. Lipid interaction for both types of proteins is mediated by 11 amino acid repeats that form amphipathic helices. This similarity suggests that synucleins and apolipoproteins might have comparable effects on lipid membranes, but this has not been shown directly. Here, we find that α-synuclein, β-synuclein, and apolipoprotein A-1 have the conserved functional ability to induce membrane curvature and to convert large vesicles into highly curved membrane tubules and vesicles. The resulting structures are morphologically similar to those generated by amphiphysin, a curvature-inducing protein involved in endocytosis. Unlike amphiphysin, however, synucleins and apolipoproteins do not require any scaffolding domains and curvature induction is mediated by the membrane insertion and wedging of amphipathic helices alone. Moreover, we frequently observed that α-synuclein caused membrane structures that had the appearance of nascent budding vesicles. The ability to function as a minimal machinery for vesicle budding agrees well with recent findings that α-synuclein plays a role in vesicle trafficking and enhances endocytosis. Induction of membrane curvature must be under strict regulation in vivo; however, as we find it can also cause disruption of membrane integrity. Because the degree of membrane curvature induction depends on the concerted action of multiple proteins, controlling the local protein density of tubulating proteins may be important. How cellular safeguarding mechanisms prevent such potentially toxic events and whether they go awry in disease remains to be determined.

The importance of curvature as a structural feature of biological membranes has been recognized for many years and has fascinated scientists from a wide range of different backgrounds. On the one hand, changes in membrane morphology are involved in a plethora of phenomena involving the plasma membrane of eukaryotic cells, including endo- and exocytosis, phagocytosis and filopodia formation. On the other hand, a multitude of intracellular processes at the level of organelles rely on generation, modulation, and maintenance of membrane curvature to maintain the organelle shape and functionality. The contribution of biophysicists and biologists is essential for shedding light on the mechanistic understanding and quantification of these processes.

The size of endocytic clathrin-coated vesicles (CCVs) is remarkably uniform, suggesting that it is optimized to achieve the appropriate levels of cargo and lipid internalization. The three most abundant proteins in mammalian endocytic CCVs are clathrin and the two cargo-selecting, clathrin adaptors, CALM and AP2. Here we demonstrate that depletion of CALM causes a substantial increase in the ratio of "open" clathrin-coated pits (CCPs) to "necked"/"closed" CCVs and a doubling of CCP/CCV diameter, whereas AP2 depletion has opposite effects. Depletion of either adaptor, however, significantly inhibits endocytosis of transferrin and epidermal growth factor. The phenotypic effects of CALM depletion can be rescued by re-expression of wild-type CALM, but not with CALM that lacks a functional N-terminal, membrane-inserting, curvature-sensing/driving amphipathic helix, the existence and properties of which are demonstrated. CALM is thus a major factor in controlling CCV size and maturation and hence in determining the rates of endocytic cargo uptake.

ABSTRACT How local interactions of actin regulators yield large-scale organization of cell shape and movement is not well understood. For example, why does the WAVE complex build lamellipodia, the broad sheet-like protrusions that power cell migration, whereas the homologous actin regulator N-WASP forms spiky finger-like actin networks? N-WASP is known to oligomerize into focal condensates that generate an actin finger. In contrast, the WAVE complex exhibits the linear distribution needed to generate an actin sheet. This linear organization of the WAVE complex could either arise from interactions with the actin cytoskeleton or could represent an ability of the complex to self-organize into a linear template. Using super-resolution microscopy, we find that the WAVE complex forms higher-order linear oligomers that curve into 270 nanometer-wide ring structures in the absence of actin polymer. These rings localize to the necks of membrane invaginations, which display saddle point geometries with positive curvature in one axis and negative curvature in the orthogonal axis. To investigate the molecular mechanism of saddle curvature enrichment, we show that the WAVE complex and IRSp53, a membrane curvature-sensitive protein, collaborate to recognize saddle curvature that IRSp53 cannot sense alone. This saddle preference for the WAVE complex could explain emergent cell behaviors, such as expanding and self-straightening lamellipodia as well as the ability of endothelial cells to recognize and seal transcellular holes. Our work highlights how partnering protein interactions enable complex shape sensing and how feedback between cell shape and actin regulators yields self-organized cell morphogenesis.

To control their shape and movement, cells leverage nucleation promoting factors (NPFs) to regulate when and where they polymerize actin. Here we investigate the role of the immune-specific NPF WASP during neutrophil migration. Endogenously-tagged WASP localizes to substrate-induced plasma membrane deformations. Super-resolution imaging of live cells reveals that WASP preferentially enriches to the necks of these substrate-induced membrane invaginations, a distribution that could support substrate pinching. Unlike other curvature-sensitive proteins, WASP only enriches to membrane deformations at the cell front, where it controls Arp2/3 complex recruitment and actin polymerization. Despite relatively normal migration on flat substrates, WASP depletion causes defects in topology sensing and directed migration on textured substrates. WASP therefore both responds to and reinforces cell polarity during migration. Surprisingly, front-biased WASP puncta continue to form in the absence of Cdc42. We propose that WASP integrates substrate topology with cell polarity for 3D guidance by selectively polymerizing actin around substrate-induced membrane deformations at the leading edge. A misregulation of WASP-mediated contact guidance could provide insight into the immune disorder Wiskott-Aldrich syndrome.

Summary paragraph Vacuolar-type adenosine triphosphatases (V-ATPases) 1–3 are electrogenic rotary mechanoenzymes structurally related to F-type ATP synthases 4,5 . They hydrolyze ATP to establish electrochemical proton gradients for a plethora of cellular processes 1,3 . In neurons, the loading of all neurotransmitters into synaptic vesicles is energized by ~1 V-ATPase molecule per synaptic vesicle 6,7 . To shed light into this bona fide single-molecule biological process, we investigated electrogenic proton pumping by single mammalian-brain V-ATPases, using individual synaptic vesicles fused with immobilized liposomes. We show V-ATPases do not pump continuously in time, as hypothesized by observing the rotation of bacterial homologs 8 and assuming strict ATP/proton coupling. Instead, they stochastically switch between three novel ultra-long-lived proton-pumping, inactive, and proton-leaky modes. Upending conventional wisdom, direct observation of pumping revealed that physiologically relevant concentrations of ATP do not regulate the intrinsic pumping rate. Instead, ATP regulates V-ATPase activity via the switching probability of the proton-pumping mode. In contrast, electrochemical proton gradients regulate the pumping rate and the switching of the pumping and inactive modes. This work reveals and emphasises the mechanistic and biological importance of mode-switching in protein regulation.

Abstract G protein-coupled receptors (GPCRs) mediate many physiological functions and are key targets in drug development 1-3 . A long-held tenet of molecular pharmacology is that GPCRs can spontaneously sample preexisting active conformations. This concept is pivotal to our understanding of ligand pharmacology 4 , however, direct evidence supporting it has only been obtained with reconstituted receptors 5-12 . Here, we introduce a method for quantitatively imaging the intrinsic activation probability of GPCRs directly at the plasma membrane of live cells, utilizing fluorescent conformational biosensors 13,14 . Our findings unveil a remarkable spatial multimodality in intrinsic activation probability, with a significant majority (up to 99%) of plasma membrane-expressed receptors showing negligible spontaneous activation. In contrast, the remaining minority of receptors exhibits spontaneous activation up to 22-fold higher than previously estimated. Experiments and theoretical calculations revealed that receptors diffuse into and out of ultralong-lived (∼5 minutes) nanodomains where the local membrane curvature allosterically enhances activation in the absence and presence of ligands. Extensive testing across five prototypic GPCRs indicates spatial nanoscale multimodality is ubiquitous, but varying in magnitude depending on the receptor and cell type. Upending conventional wisdom, this study reveals that drug efficacy is not a constant number but a spatiotemporal function ε (x, y, z, t) whose properties define and multiplex the signaling potency and efficacy of ternary complexes of GPCRs and likely other plasma membrane-receptors. Graphical Abstract GPCR spontaneous activation and intrinsic efficacy are not uniform across the plasma membrane but exhibit ultralong-lived spatial multimodality . Spatial variations in the curvature and composition of the plasma membrane, lead to the emergence of ultralong-lived nanodomains with contrasting physicochemical properties that allosterically regulate GPCR conformations. This results in a multimodal landscape of intrinsic efficacy ϵ (x, y, z, t) that ultimately governs cell signaling. XY scalebar: 500 nm. Z-range: 100 nm.