The Arp2/3 complex regulates endocytosis, sorting, and trafficking, yet the Arp2/3-stimulating factors orchestrating these distinct events remain ill defined. WASH (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein and SCAR Homolog) is an Arp2/3 activator with unknown function that was duplicated during primate evolution. We demonstrate that WASH associates with tubulin and localizes to early endosomal subdomains, which are enriched in Arp2/3, F-actin, and retromer components. Although WASH localized with activated receptors, it was not essential for endocytosis. However, WASH did regulate retromer-mediated retrograde CI-MPR trafficking, which required its association with endosomes, Arp2/3-directed F-actin regulation, and tubulin interaction. Moreover, WASH exists in a multiprotein complex containing FAM21, which links WASH to endosomes and is required for WASH-dependent retromer-mediated sorting. Significantly, without WASH, retromer tubulation was exaggerated, supporting a model wherein WASH links retromer-mediated cargo containing tubules to microtubules for Golgi-directed trafficking and generates F-actin-driven force for tubule scission.

SLC7A11-mediated cystine uptake suppresses ferroptosis yet promotes cell death under glucose starvation; the nature of the latter cell death remains unknown. Here we show that aberrant accumulation of intracellular disulfides in SLC7A11high cells under glucose starvation induces a previously uncharacterized form of cell death distinct from apoptosis and ferroptosis. We term this cell death disulfidptosis. Chemical proteomics and cell biological analyses showed that glucose starvation in SLC7A11high cells induces aberrant disulfide bonds in actin cytoskeleton proteins and F-actin collapse in a SLC7A11-dependent manner. CRISPR screens and functional studies revealed that inactivation of the WAVE regulatory complex (which promotes actin polymerization and lamellipodia formation) suppresses disulfidptosis, whereas constitutive activation of Rac promotes disulfidptosis. We further show that glucose transporter inhibitors induce disulfidptosis in SLC7A11high cancer cells and suppress SLC7A11high tumour growth. Our results reveal that the susceptibility of the actin cytoskeleton to disulfide stress mediates disulfidptosis and suggest a therapeutic strategy to target disulfidptosis in cancer treatment. Liu, Nie et al. identify disulfidptosis as a form of cell death resulting from aberrant accumulation of disulfide bonds in actin cytoskeleton proteins that is induced following glucose starvation and dependent on SLC7A11-mediated cystine uptake.

Members of the Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP) family control cytoskeletal dynamics by promoting actin filament nucleation with the Arp2/3 complex. The WASP relative WAVE regulates lamellipodia formation within a 400-kilodalton, hetero-pentameric WAVE regulatory complex (WRC). The WRC is inactive towards the Arp2/3 complex, but can be stimulated by the Rac GTPase, kinases and phosphatidylinositols. Here we report the 2.3-ångstrom crystal structure of the WRC and complementary mechanistic analyses. The structure shows that the activity-bearing VCA motif of WAVE is sequestered by a combination of intramolecular and intermolecular contacts within the WRC. Rac and kinases appear to destabilize a WRC element that is necessary for VCA sequestration, suggesting the way in which these signals stimulate WRC activity towards the Arp2/3 complex. The spatial proximity of the Rac binding site and the large basic surface of the WRC suggests how the GTPase and phospholipids could cooperatively recruit the complex to membranes. The WAVE protein is a central regulator of actin dynamics during cell motility. WAVE is a member of the Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP) family, which promotes the actin-filament-nucleating activity of the Arp2/3 complex. In cells, WAVE is constitutively incorporated into the 350-kilodalton WAVE regulatory complex (WRC); it is normally present in an inactive state and can be activated by a number of inputs including the RacGTPase. Here, Chen et al. present the structure and mechanistic analysis of the WRC. The combined data reveal how the WAVE protein is inhibited within the WRC complex and provide mechanisms for WRC activation at the plasma membrane. In cells, WAVE protein, a central regulator of actin dynamics during cell motility, is constitutively incorporated into WAVE regulatory complex (WRC), is normally present in an inactive state and can be activated by a number of inputs. These authors present the structure and mechanistic analysis of WRC. The combined data reveal how the WAVE protein is inhibited within the WRC complex and provide mechanisms for WRC activation at the plasma membrane.

Abstract Cell-surface receptors control how cells respond to their environment. Many cell-surface receptors recycle from endosomes to the plasma membrane via a recently discovered pathway, which includes sorting-nexin SNX17, Retriever, WASH and CCC complexes. Here we discover that PIKfyve and its upstream PI3-kinase VPS34 positively regulate this pathway. VPS34 produces PI3P, which is the substrate for PIKfyve to generate PI3,5P 2 . We show that PIKfyve controls recycling of cargoes including integrins, receptors that control cell migration. Furthermore, endogenous PIKfyve colocalizes with SNX17, Retriever, WASH and CCC complexes on endosomes. Importantly, PIKfyve inhibition causes a loss of Retriever and CCC from endosomes, and mutation of the lipid binding site on a CCC subunit impairs its endosomal localization and delays integrin recycling. In addition, we show that recruitment of SNX17 is an early step and requires VPS34. These discoveries suggest that VPS34 and PIKfyve coordinate an ordered pathway to regulate recycling from endosomes and suggest how PIKfyve functions in cell migration.

Abstract During endosomal recycling, Sorting Nexin 17 (SNX17) facilitates the transport of numerous membrane cargo proteins by tethering them to the Retriever complex. Despite its importance, the mechanisms underlying this interaction have remained elusive. Here, we report the structure of the Retriever-SNX17 complex determined using cryogenic electron microscopy (cryo-EM). Our structure reveals that the C-terminal tail of SNX17 engages with a highly conserved interface between the VPS35L and VPS26C subunits of Retriever. Through comprehensive biochemical, cellular, and proteomic analyses, we demonstrate that disrupting this interface impairs the Retriever-SNX17 interaction, subsequently affecting the recycling of SNX17-dependent cargos and altering the composition of the plasma membrane proteome. Intriguingly, we find that the SNX17-binding pocket on Retriever can be utilized by other ligands that share a consensus acidic C-terminal tail motif. By showing how SNX17 is linked to Retriever, our findings uncover a fundamental mechanism underlying endosomal trafficking of critical cargo proteins and reveal a mechanism by which Retriever can engage with other regulatory factors.

Summary Crosstalk between Rho- and Arf-family GTPases plays an important role in linking actin cytoskeletal remodeling to membrane protrusion, organelle structure, and vesicle trafficking. The central actin regulator, WAVE Regulatory Complex (WRC), is a converging point of Rac1 (a Rho-family GTPase) and Arf signaling in many processes, but how Arf promotes WRC activation is unknown. Here we reconstituted a direct interaction between Arf and WRC. This interaction can be greatly enhanced by Rac1 binding to the D site of the WRC. Arf1 binds to a newly identified conserved surface on Sra1 located between the D site and the WH2 helix of WAVE1, which can drive WRC activation using a mechanism distinct from that of Rac1. Mutating Arf binding site abolishes Arf1-WRC interaction, disrupts Arf1-mediated WRC activation, and impairs lamellipodia morphology. This work uncovers a new mechanism underlying WRC activation and provides a mechanistic foundation for studying how WRC-mediated actin polymerization links Arf and Rac signaling in the cell.

Vesicle trafficking is a fundamental process that allows for the sorting and transport of specific proteins (i.e., "cargoes") to different compartments of eukaryotic cells. Cargo recognition primarily occurs through coats and the associated proteins at the donor membrane. However, it remains unclear whether cargoes can also be selected at other stages of vesicle trafficking to further enhance the fidelity of the process. The WDR11-FAM91A1 complex functions downstream of the clathrin-associated AP-1 complex to facilitate protein transport from endosomes to the TGN. Here, we report the cryo-EM structure of human WDR11-FAM91A1 complex. WDR11 directly and specifically recognizes a subset of acidic clusters, which we term super acidic clusters (SACs). WDR11 complex assembly and its binding to SAC-containing proteins are indispensable for the trafficking of SAC-containing proteins and proper neuronal development in zebrafish. Our studies thus uncover that cargo proteins could be recognized in a sequence-specific manner downstream of a protein coat.

During the humoral immune response, B cells undergo rapid metabolic reprogramming with a high demand for nutrients, which are vital to sustain the formation of the germinal centers (GCs). Rag-GTPases sense amino acid availability to modulate the mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) pathway and suppress transcription factor EB (TFEB) and transcription factor enhancer 3 (TFE3), members of the microphthalmia (MiT/TFE) family of HLH-leucine zipper transcription factors. However, how Rag-GTPases coordinate amino acid sensing, mTORC1 activation, and TFEB/TFE3 activity in humoral immunity remains undefined. Here, we show that B cell-intrinsic Rag-GTPases are critical for the development and activation of B cells. RagA/RagB deficient B cells fail to form GCs, produce antibodies, and generate plasmablasts in both T-dependent (TD) and T-independent (TI) humoral immune responses. Deletion of RagA/RagB in GC B cells leads to abnormal dark zone (DZ) to light zone (LZ) ratio and reduced affinity maturation. Mechanistically, the Rag-GTPase complex constrains TFEB/TFE3 activity to prevent mitophagy dysregulation and maintain mitochondrial fitness in B cells, which are independent of canonical mTORC1 activation. TFEB/TFE3 deletion restores B cell development, GC formation in Peyer's patches and TI humoral immunity, but not TD humoral immunity in the absence of Rag-GTPases. Collectively, our data establish Rag-GTPase-TFEB/TFE3 pathway as an mTORC1 independent mechanism to coordinating nutrient sensing and mitochondrial metabolism in B cells.

The recycling of membrane proteins from endosomes to the cell surface is vital for cell signaling and survival. Retriever, a trimeric complex of VPS35L, VPS26C and VPS29, together with the CCC complex comprising CCDC22, CCDC93, and COMMD proteins, plays a crucial role in this process. The precise mechanisms underlying Retriever assembly and its interaction with CCC have remained elusive. Here, we present the first high-resolution structure of Retriever determined using cryogenic electron microscopy. The structure reveals a unique assembly mechanism, distinguishing it from its remotely related paralog, Retromer. By combining AlphaFold predictions and biochemical, cellular, and proteomic analyses, we further elucidate the structural organization of the entire Retriever-CCC complex and uncover how cancer-associated mutations disrupt complex formation and impair membrane protein homeostasis. These findings provide a fundamental framework for understanding the biological and pathological implications associated with Retriever-CCC-mediated endosomal recycling.