Study question Can single-nuclei and bulk RNA sequencing technologies be used to elucidate novel mechanisms of ovarian insufficiency in Turner Syndrome (TS)? Summary answer Using single-nucleus and bulk RNA sequencing approaches, we identified novel potential pathogenic mechanisms underlying ovarian insufficiency in TS including and beyond X chromosome haploinsufficiency. What is known already Turner syndrome (TS) is the most common genetic cause of Primary Ovarian Insufficiency (POI) in humans. Morphological analyses of human fetal 45,X ovaries have demonstrated fewer germ cells and marked apoptosis established by 15-20 weeks post conception (wpc); however, we do not understand why POI develops mechanistically in the first instance. Study design, size, duration Single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq): two 46,XX and two 45,X (TS) human fetal ovaries at 12-13 wpc. Bulk RNA sequencing: 19 human fetal ovary, 20 fetal testis, and 8 fetal control tissue (n=47 total samples; Carnegie Stage 22-16wpc). Participants/materials, setting, methods To identify novel potential mechanisms of ovarian insufficiency in TS and to characterise X chromosome gene expression in the 45,X ovary, we performed snRNA-seq of peri-meiotic 46,XX (n=2) and 45,X (n=2) fetal ovaries at 12-13 weeks post conception (wpc); and 2) a bulk RNA sequencing time-series analysis of fetal ovary, testis, and control samples across four developmental timepoints. Main results and the role of chance Germ and somatic cell subpopulations were mostly shared across 46,XX and 45,X ovaries, aside from a 46XX-specific/45,X-depleted cluster of oogonia (“synaptic oogonia”) containing genes with functions relating to sex chromosome synapsis; histone modification; intracellular protein regulation and chaperone systems. snRNA-seq enabled accurate cell counting localised to individual cell clusters; the 45,X ovary has fewer germ cells than the 46,XX ovary in every germ cell subpopulation, confirmed by histopathological analysis. The normal sequence of X-chromosome inactivation and reactivation is disrupted in 45,X ovaries; XIST was not expressed in 45,X somatic cells but was present in germ cell clusters, albeit with lower expression than in corresponding 46,XX clusters. The 45,X ovary has a globally abnormal transcriptome, with low expression of genes with proteostasis functions ( RSP4X ); cell cycle progression ( BUB1B ); and OXPHOS mitochondrial energy production ( COX6C, ATP11C ). Genes with higher expression in 45,X cell populations were enriched for apoptotic functions (e.g., NR4A1 ). Limitations, reasons for caution Limitations include the relatively small sample size of the snRNA-seq analysis and the focus on a fixed meiotic timepoint which may overlook a dynamic process over time. Wider implications of the findings We characterise the human fetal peri-meiotic 45,X ovary at single-cell resolution and offer insights into novel pathogenic mechanisms underlying ovarian insufficiency in TS. Although asynapsis due to X chromosome haploinsufficiency likely plays a significant role, these data suggest meiotic failure and ovarian insufficiency may be a combinatorial process characterised by periods of vulnerability throughout early 45,X germ cell development Study funding/competing interest(s) This research was funded in whole, or in part, by the Wellcome Trust Grants 216362/Z/19/Z to SMcG-B and 209328/Z/17/Z to JCA. Human fetal material was provided by the Joint MRC/Wellcome Trust (Grant MR/R006237/1) Human Developmental Biology Resource ( http://www.hdbr.org ). Research at UCL Great Ormond Street Institute of Child Health is supported by the National Institute for Health Research, Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre (grant IS-BRC-1215-20012).

Abstract The influence of sex chromosomes and sex hormones on early human brain development is poorly understood. We therefore undertook transcriptomic analysis of 46,XY and 46,XX human brain cortex samples (n=64) at four different time points between 7.5 and 17 weeks post conception (wpc), in two independent studies. This developmental period encompasses the onset of testicular testosterone secretion in the 46,XY fetus (8wpc). Differences in sex chromosome gene expression included X-inactivation genes ( XIST , TSIX ) in 46,XX samples; core Y chromosome genes (n=18) in 46,XY samples; and two Y chromosome brain specific genes, PCDH11Y and RP11-424G14.1 . PCDH11Y (protocadherin11 Y-linked ) regulates excitatory neurons; this gene is unique to humans and is implicated in language development. RP11-424G14.1 is a novel long non-coding RNA. Fewer differences in sex hormone pathway-related genes were seen. The androgen receptor ( AR , NR4A2) showed cortex expression in both sexes, which decreased with age. Global cortical sex hormone effects were not seen, but more localized AR mechanisms may be important with time (e.g., hypothalamus). Taken together, our data suggest that limited but potentially important sex differences occur during early human fetal brain development.

The complex genetic mechanisms underlying human ovary development can give rise to clinical phenotypes if disrupted, such as Primary Ovarian Insufficiency and Differences of Sex Development. Through a clinically-focused lens, we combine single-nuclei RNA sequencing, bulk RNA sequencing, and micro-focus computed tomography to elucidate the anatomy and transcriptional landscape of the human fetal ovary across key developmental timepoints (Carnegie Stage 22 until 20 weeks post conception). We show the marked growth and distinct morphological changes within the fetal ovary at the critical timepoint of germ cell expansion, and demonstrate that the fetal ovary becomes more transcriptomically distinct from the testis with age. We describe novel ovary developmental pathways, relating to neuroendocrine signalling, energy homeostasis, mitochondrial networks, piRNA processes, and inflammasome regulation. We define transcriptional regulators and candidate genes for meiosis within the developing ovary. Together, this work advances our fundamental understanding of human ovary development and clinical ovarian insufficiency phenotypes.

Abstract The adrenal glands synthesize and release essential steroid hormones such as cortisol and aldosterone, but the mechanisms underlying human adrenal gland development are not fully understood. Here, we combined single-cell and bulk RNA-sequencing, spatial transcriptomics, immunohistochemistry and micro-focus computed tomography to investigate key aspects of adrenal development in the first 20 weeks of gestation. We demonstrate rapid adrenal growth and vascularization, with cell division in the outer definitive zone (DZ). Steroidogenic pathways favor androgen synthesis in the central fetal zone (FZ), but DZ capacity to synthesize cortisol and aldosterone develops with time. Core transcriptional regulators were identified, with a role for HOPX in the DZ. Potential ligand- receptor interactions between mesenchyme and adrenal cortex were seen (e.g., RSPO3 / LGR4 ). Growth-promoting imprinted genes were enriched in the developing cortex (e.g. IGF2, PEG3 ). These findings reveal new aspects of human adrenal development, and have clinical implications for understanding primary adrenal insufficiency and related postnatal adrenal disorders, such as adrenal tumor development, steroid disorders and neonatal stress.