Extracellular vesicles (EVs) such as exosomes and microvesicles serve as messengers of intercellular network, allowing exchange of cellular components between cells. EVs carry lipids, proteins, and RNAs derived from their producing cells, and have potential as biomarkers specific to cell types and even cellular states. However, conventional methods (such as ultracentrifugation or polymeric precipitation) for isolating EVs have disadvantages regarding purity and feasibility. Here, we have developed a novel method for EV purification by using Tim4 protein, which specifically binds the phosphatidylserine displayed on the surface of EVs. Because the binding is Ca2+-dependent, intact EVs can be easily released from Tim4 by adding Ca2+ chelators. Tim4 purification, which we have applied to cell conditioned media and biofluids, is capable of yielding EVs of a higher purity than those obtained using conventional methods. The lower contamination found in Tim4-purified EV preparations allows more EV-specific proteins to be detected by mass spectrometry, enabling better characterization and quantification of different EV populations' proteomes. Tim4 protein can also be used as a powerful tool for quantification of EVs in both ELISA and flow cytometry formats. Thus, the affinity of Tim4 for EVs will find abundant applications in EV studies.

Limited infiltration and activity of natural killer (NK) and T cells within the tumor microenvironment (TME) correlate with poor immunotherapy responses. Here, we examined the role of the endonuclease Regnase-1 on NK cell anti-tumor activity. NK cell-specific deletion of Regnase-1 (Reg1

Abstract Single cell transcriptomic approaches are becoming mainstream, with replicate experiments commonly performed with the same single cell technology. Methods that enable integration of these datasets by removing batch effects while preserving biological information are required for unbiased data interpretation. Here we introduce Canek for this purpose. Canek leverages information from mutual nearest neighbor to combine local linear corrections with cell-specific non-linear corrections within a fuzzy logic framework. Using a combination of real and synthetic datasets, we show that Canek corrects batch effects while introducing the least amount of bias compared with competing methods. Canek is computationally efficient and can easily integrate thousands of single-cell transcriptomes from replicated experiments.

Regulated neural-metabolic-inflammatory responses are essential for maintaining physiological homeostasis. However, the molecular machinery that coordinates neural, metabolic, and inflammatory responses is largely unknown. Here, we show that semaphorin 6D (SEMA6D) coordinates anxiogenic, metabolic, and inflammatory outputs from the amygdala by maintaining synaptic homeostasis. Using genome-wide approaches, we identify SEMA6D as a pleiotropic gene for both psychiatric and metabolic traits in human. Sema6d deficiency increases anxiety in mice. When fed a high-fat diet, Sema6d−/− mice display attenuated obesity and enhanced myelopoiesis compared with control mice due to higher sympathetic activity via the β3-adrenergic receptor. Genetic manipulation and spatial and single-nucleus transcriptomics reveal that SEMA6D in amygdalar interneurons is responsible for regulating anxiogenic and autonomic responses. Mechanistically, SEMA6D is required for synaptic maturation and γ-aminobutyric acid transmission. These results demonstrate that SEMA6D is important for the normal functioning of the neural circuits in the amygdala, coupling emotional, metabolic, and inflammatory responses.

ABSTRACT With the growing complexity of single-cell and spatial genomics data, there is an increasing importance of unbiased and efficient exploratory data analysis tools. One common exploratory data analysis step is the prediction of genes with different levels of activity in a subset of cells or locations inside a tissue. We previously developed singleCellHaystack, a method for predicting differentially expressed genes from single-cell transcriptome data, without relying on clustering of cells. Here we present an update to singleCellHaystack, which is now a universally applicable method for predicting differentially active features: 1) singleCellHaystack now accepts continuous features that can be RNA or protein expression, chromatin accessibility or module scores from single-cell, spatial and even bulk genomics data, and 2) it can handle 1D trajectories, 2-3D spatial coordinates, as well as higher-dimensional latent spaces as input coordinates. Performance has been drastically improved, with up to ten times reduction in computational time and scalability to millions of cells, making singleCellHaystack a suitable tool for exploratory analysis of atlas level datasets. singleCellHaystack is available as an R package and Python module

Abstract Mutations in the ZAP-70 gene that cause moderate attenuation of T cell receptor (TCR) signaling in mice, can result in autoimmune manifestations akin to rheumatoid arthritis (RA). Here, we characterized the single-cell gene expression profiles and TCR repertoires of conventional (Tconv) and regulatory (Treg) CD4 + T cells of arthritic (ZAC), poised (SKG) ZAP-70 mutant, and wild-type (WT) mice. We identified two Th17 cell subtypes in the joints of ZAC mice that were characterized by distinct transcriptional profiles and TCR repertoires, one of which exhibited a pathogenic signature and occurred exclusively in inflamed joints. Such a pathogenic signature was also uniquely detected in CD4 + T cells obtained from inflamed joints of human RA patients. The TCR repertoire of pathogenic Th17 cells showed signs of increased intra-repertoire similarity (convergence) and was skewed toward the WT Treg rather than the WT Tconv repertoire. In addition, the overall similarity between the Treg and Tconv repertoires was severely reduced in arthritic mice. Our results support a model where, upon moderate ZAP-70-mediated signal weakening, T cells that would normally develop into Tregs, instead develop into self-reactive Tconvs, resulting in a breakdown in self-tolerance and susceptibility to autoimmune arthritis.

Abstract In-depth knowledge of the cellular and molecular composition of dental pulp (DP) and the crosstalk between DP cells that drive tissue homeostasis or regeneration are not well understood. To address these questions, we performed data analysis of publicly available single-cell transcriptomes of DP. This analysis revealed that DP resident fibroblasts have a unique gene expression profile when compared with fibroblasts from 5 other reference tissues: blood, bone marrow, adipose tissue, lung, and skin. Genes coded for heparin-binding growth-factors, pleiotrophin (PTN) and midkine (MDK), possessed the highest differential expression levels in DP fibroblasts. In addition, we identified extensive crosstalk between DP fibroblasts and several other DP cells, including Schwann cells, MSCs and odontoblasts. These findings suggest that fibroblast-derived growth factors regulate DP niches, and thus have a potential role as dental therapeutic targets.

Summary A common analysis of single-cell sequencing data includes dimensionality reduction using t-SNE or UMAP, clustering of cells, and identifying differentially expressed genes. How cell clusters are defined has important consequences in the interpretation of results and downstream analyses, but is often not straightforward. To address this difficulty, we present a new approach called singleCellHaystack that enables the identification of differentially expressed genes (DEGs) without relying on explicit clustering of cells. Our method uses Kullback-Leibler Divergence to find genes that are expressed in subsets of cells that are non-randomly positioned in a multi-dimensional space. We illustrate the usage of singleCellHaystack through applications on several single-cell datasets, demonstrate that it enables the identification of markers important for cell subset separation in an unbiased way, and compare its results with those of a traditional, clustering-based DEG prediction method.Availability and implementation singleCellHaystack is implemented as an R package and is available from Contact alexisvdb{at}infront.kyoto-u.ac.jp