Single murine and human intestinal stem cells can be expanded in culture over long time periods as genetically and phenotypically stable epithelial organoids. Increased cAMP levels induce rapid swelling of such organoids by opening the cystic fibrosis transmembrane conductor receptor (CFTR). This response is lost in organoids derived from cystic fibrosis (CF) patients. Here we use the CRISPR/Cas9 genome editing system to correct the CFTR locus by homologous recombination in cultured intestinal stem cells of CF patients. The corrected allele is expressed and fully functional as measured in clonally expanded organoids. This study provides proof of concept for gene correction by homologous recombination in primary adult stem cells derived from patients with a single-gene hereditary defect.

Abstract Axolotl ( Ambystoma mexicanum ) is a critically endangered salamander species and a model organism for regenerative and developmental biology. Despite life-long neoteny in nature and in captive-bred colonies, metamorphosis of these animals can be experimentally induced by administering Thyroid hormones (THs). However, biological consequences of this experimental procedure, such as host microbiota response and implications for regenerative capacity, remain largely unknown. Here, we systematically compared host bacterial microbiota associated with skin, stomach, gut tissues and fecal samples based on 16S rRNA gene sequences, along with limb regenerative capacity, between neotenic and metamorphic Axolotls. Our results show that distinct bacterial communities inhabit individual organs of Axolotl and undergo substantial restructuring through metamorphosis. Drastic restructuring was observed for skin microbiota, highlighted by a major transition from Firmicutes -enriched to Proteobacteria -enriched relative abundance and precipitously decreased diversity. Remarkably, shifts in microbiota was accompanied by a steep reduction in limb regenerative capacity. Fecal microbiota of neotenic and metamorphic Axolotl shared relatively higher similarity, suggesting that diet continues to shape microbiota despite fundamental transformations in the host digestive organs. The results provide novel insights into microbiological and regenerative aspects of Axolotl metamorphosis and will establish a baseline for future in-depth studies.

Abstract Breast invasive cancer (BIC) is one of the most commonly observed and the deadliest cancer among women. Despite the progress that has been made in improving breast cancer outcomes by the development of advanced treatment options, due to the heterogeneity and complexity of the disease, more studies are required to explore underlying molecular mechanisms of breast cancer which may provide useful insights to overcome the constraints related to current therapeutic options. The goal of this study was to reveal the crucial roles of m6A regulatory proteins in BIC development using various publicly available datasets and databases. We first conducted a comprehensive analysis to depict the mutation frequency and types for m6A regulatory genes in sub-types of BIC for the evaluation of the genetic alterations landscape of breast cancer. Changes in expression levels of m6A regulatory factors were identified as the key genetic alteration in BIC. Implementation of Kaplan-Meier tool to assess the predictive value of m 6 A pathway components in BIC validated the use of VIRMA, METTL14, RBM15B, EIF3B, YTHDF1, and YTHDF3 as prognostic biomarkers of breast cancer. We then examined the enriched gene ontology (GO) terms and KEGG pathways for the tumor samples with genetic alterations in the m 6 A pathway. Dysregulation of m 6 A regulatory factors in BIC was associated with cell division and survival-related pathways such as ‘nuclear division’ and ‘chromosome segregation’ via the upregulation of the genes functioning in these biological processes and the gained overactivity of these pathways may account for poor prognosis of the disease. The performed analyses highlighted m 6 A pathway genes as potential regulators of BIC growth and as a valuable set to be utilized as clinical biomarkers in BIC disease.

Abstract Grade IV neoplasm of the central nervous system, GBM, is associated with poor prognosis and relatively short overall survival. Due to the current limitations in treatment methods, GBM is characterized as an incurable disease, and research to advance therapeutic options is required. Conditioned medium is commonly used in in-vitro studies complementary to animal experiments to simulate tumor microenvironment and has the potential to challenge and expand our current understanding of secretome effect on tumor characteristics. This study aimed to investigate the effects of conditioned mediums of GBM cell lines on each other. Conditioned mediums’ cellular and molecular effects were evaluated using commonly employed techniques such as MTT assay, colony formation assay, wound healing assay, EdU labeling-based flow cytometry, and qRT-PCR. Our study demonstrated that conditioned medium harvested from U87 or LN229 cells at 48 th h exhibited an anti-growth activity on each other by changing the gene expression pattern. Furthermore, the conditioned medium of LN229 decreased the migration capacity of U87 cells, and the conditioned medium of U87 cells significantly suppressed the LN229 proliferation. We believe that this initial work provides new insights for a better understanding of GBM cell lines’ secretome roles and highlights the necessity of further studies to unveil the secretome content. Highlights Conditioned medium harvested from GBM cells at different time points displayed various effects. Conditioned medium of GBM cell lines harvested at 48 th h decreased the viability of each other. The expression level of anti-and pro-proliferative genes is altered upon condition medium treatment.

Regeneration-capable flatworms are informative research models to study the mechanisms of stem cell regulation, regeneration and tissue patterning. However, the lack of transgenesis methods significantly hampers their wider use. Here we report development of a transgenesis method for Macrostomum lignano, a basal flatworm with excellent regeneration capacity. We demonstrate that microinjection of DNA constructs into fertilized one-cell stage eggs, followed by a low dose of irradiation, frequently results in random integration of the transgene in the genome and its stable transmission through the germline. To facilitate selection of promoter regions for transgenic reporters, we assembled and annotated the M. lignano genome, including genome-wide mapping of transcription start regions, and showed its utility by generating multiple stable transgenic lines expressing fluorescent proteins under several tissue-specific promoters. The reported transgenesis method and annotated genome sequence will permit sophisticated genetic studies on stem cells and regeneration using M. lignano as a model organism.

Abstract Prostate cancer (PCa) is the most commonly diagnosed cancer in men. Expanding evidence suggests a significant association between cancer progression and RNA modifications. However, our knowledge of the link between m5C and hm5C pathways with PCa is limited. Therefore, we aimed to explore the diagnostic and prognostic values of m5C and hm5C regulators in PCa. In this study, genetic alterations in m5C and hm5C regulators were identified using publicly available databases. Differentially expressed genes in these pathways between tumor and nontumor samples, correlation among m5C and hm5C pathway members, and prognostic value of the regulators were evaluated. Furthermore, enrichment of gene ontology (GO) terms and KEGG pathways was carried out. Obtained results unveiled the mRNA level differences as the key genetic alterations for m5C and hm5C regulators between tumor and nontumor samples. UHRF1, TET3, and NEIL1 were significantly upregulated in tumor samples compared to nontumor ones, whereas EGR1 was significantly downregulated. UHRF1, DNMT1, NSUN2, NSUN4, C1orf77, C3orf37, WDR77, NEIL1 , and TDG genes were identified as candidate prognostic markers of overall survival. The upregulated genes in patient samples with genetic alterations in m5C and hm5C pathways enriched cell cycle-related processes. In summary, our findings suggest that the m5C and hm5C regulators might play a role in PRAD development by activation of proliferation, and the UHRF1, NSUN2 , and NEIL1 genes have the potential to be utilized as clinical biomarkers.

The axolotl (Ambystoma Mexicanum) salamander, an urodele amphibian, has an exceptional regenerative capacity to fully restore an amputated limb throughout the life-long lasting neoteny. By contrast, when axolotls are experimentally induced to metamorphosis, attenuation of the limb's regenerative competence is noticeable. Here, we sought to discern the proteomic profiles of the early stages of blastema formation of neotenic and metamorphic axolotls after limb amputation by means of LC-MS/MS technology. We quantified a total of 714 proteins having an adjusted p < 0.01 with FC greater or equal to 2 between two conditions. Principal component analysis revealed a conspicuous clustering between neotenic and metamorphic samples at 7 days post-amputation. Different set of proteins was identified as differentially expressed at all of the time points (1, 4, and 7 days post-amputations against day0) for neotenic and metamorphic stages. Although functional enrichment analyses underline the presence of common pathways between regenerative and non-regenerative stages, cell proliferation and its regulation associated pathways, immune system related pathways and muscle tissue and ECM remodeling and degradation pathways were represented at different rate between both stages. To validate the proteomics results and provide evidence for the putative link between immune system activity and regenerative potential, qRT-PCR for selected genes was performed. Raw data used in this study is available via ProteomeXchange with identifier XXYY.

Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a urodele amphibian endowed with remarkable regenerative capacities manifested in scarless wound healing and full restoration of amputated limbs. Several regenerative cues of the axolotl limb were successfully unraveled due to the advent of high-throughput technologies and their employment in tackling research questions on several OMICS levels. The field of regenerative biology and medicine has therefore utilized the axolotl as a major and powerful experimental model. Studies which have previously unraveled differentially expressed (DE) genes en masse in different phases of the axolotl limb regeneration have primarily used microarrays and RNA-Seq technologies. However, as different labs are conducting such experiments, sufficient consistency may be lacking due to statistical limitations arising from limited number of sample replicates as well as possible differences in study designs. This study, therefore, aims to bridge such gaps by performing an integrative analysis of publicly available microarray and RNA-Seq data from axolotl limb samples having comparable study designs. Three biological groups were conceived for the analysis; homeostatic tissues (control group), from amputation/injury timepoint up to around 50 hours post amputation (wound healing group), and from 50 hours to 28 days post amputation/injury (regenerative group). Integrative analysis was separately carried out on the selected microarray and RNA-Seq data from axolotl limb samples using the 'merging' method. Differential expression analysis was separately implemented on the processed data from both technologies using the R/Bioconductor 'limma' package. A total of 1254 genes (adjusted P < 0.01) were found DE in regenerative samples compared to the control, out of which 351 showed magnitudes of Log Fold Changes (LogFC) > 1 and were identified as the top DE genes from data of both technologies. Downstream analyses illustrated consistent correlations of the logFCs of DE genes distributed among the biological comparisons, within and between both technologies. Gene ontology annotations demonstrated concordance with the literature on the biological process involved in the axolotl limb regeneration. Future studies may benefit from the utilized concept and approach for enhanced statistical power and robust discovery of biomarkers of regeneration.

ABSTRACT The intricate relationship between regeneration and microbiota has recently gained attention, spanning diverse model organisms. Axolotl ( Ambystoma mexicanum ) is a critically endangered salamander species and a model organism for regenerative and developmental biology. Despite its significance, a noticeable gap exists in understanding the interplay between axolotl regeneration and its microbiome. Here, we analyze in depth bacterial 16S rRNA amplicon dataset that we reported before as data resource and profile fungal community by sequencing ITS amplicons at the critical stages of limb regeneration (0-1-4-7-30-60 days post amputation, “dpa”). Results reveal a decline in richness and evenness in the course of limb regeneration, with bacterial community richness recovering beyond 30 dpa unlike fungi community. Beta diversity analysis reveals precise restructuring of the bacterial community along the three phases of limb regeneration, contrasting with less congruent changes in the fungal community. Temporal dynamics of the bacterial community highlight prevalent anaerobic bacteria in initiation phase and Flavobacterium bloom in the early phase correlating with limb blastema proliferation. Predicted functional analysis mirrors these shifts, emphasizing a transition from amino acid metabolism to lipid metabolism control. Fungal communities shift from Blastomycota to Ascomycota dominance in the late regeneration stage. Our findings provide ecologically relevant insights into stage specific role of microbiome contributions to axolotl limb regeneration.

Abstract The Hippo pathway plays an imperative role in cellular processes such as differentiation, regeneration, cell migration, organ growth, apoptosis, and cell cycle. Transcription coregulator component of Hippo pathway, YAP1, promotes transcription of genes involved in cell proliferation, migration, differentiation, and suppressing apoptosis. However, its role in epimorphic regeneration has not been fully explored. The axolotl is a well-established model organism for developmental biology and regeneration studies. By exploiting its remarkable regenerative capacity, we investigated the role of Yap1 in the early blastema stage of limb regeneration. Depleting Yap1 using gene-specific morpholinos attenuated the competence of axolotl limb regeneration evident in bone formation defects. To explore the affected downstream pathways from Yap1 down-regulation, the gene expression profile was examined by employing LC-MS/MS technology. Based on the generated data, we provided a new layer of evidence on the putative roles of increased protease inhibition and immune system activities and altered ECM composition in diminished bone formation capacity during axolotl limb regeneration upon Yap1 deficiency. We believe that new insights into the roles of the Hippo pathway in complex structure regeneration were granted in this study.