Abstract The dynamics of cellular membrane tension and its role in mechanosensing, which is the ability of cells to respond to physical stimuli, remain incompletely understood, mainly due to the lack of appropriate tools. Here, we report a force-controlled nanopipette-based method that combines fluidic force microscopy with fluorescence imaging for precise manipulation of the cellular membrane tension while monitoring the impact on single-cell mechanosensitivity. The force-controlled nanopipette enables control of the indentation force imposed on the cell cortex as well as of the aspiration pressure applied to the plasma membrane. We show that this setup can be used to concurrently monitor the activation of Piezo1 mechanosensitive ion channels via calcium imaging. Moreover, the spatiotemporal behavior of the tension propagation is assessed with the fluorescent membrane tension probe Flipper-TR, and further dissected using molecular dynamics modeling. Finally, we demonstrate that aspiration and indentation act independently on the cellular mechanobiological machinery, that indentation induces a local pre-tension in the membrane, and that membrane tension stays confined by links to the cytoskeleton.

Bottom-up neuroscience, which consists of building and studying controlled networks of neurons in vitro , is a promising method to investigate information processing at the neuronal level. However, in vitro studies tend to use cells of animal origin rather than human neurons, leading to conclusions that might not be generalizable to humans and limiting the possibilities for relevant studies on neurological disorders. Here we present a method to build arrays of topologically controlled circuits of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived neurons. The circuits consist of 4 to 50 neurons with mostly unidirectional connections, confined by microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) membranes. Such circuits were characterized using optical imaging and microelectrode arrays (MEAs). Electrophysiology recordings were performed on circuits of human iPSC-derived neurons for at least 4.5 months. We believe that the capacity to build small and controlled circuits of human iPSC-derived neurons holds great promise to better understand the fundamental principles of information processing and storing in the brain.

ABSTRACT Novel in vitro platforms based on human neurons are needed to improve early drug testing and address the stalling drug discovery in neurological disorders. Topologically controlled circuits of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived neurons have the potential to become such a testing system. In this work, we build in vitro co-cultured circuits of human iPSC-derived neurons and rat primary glial cells using microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) structures on microelectrode arrays (MEAs). Such circuits are created by seeding either dissociated cells or pre-aggregated spheroids at different neuron-to-glia ratios. Furthermore, an antifouling coating is developed to prevent axonal overgrowth in undesired locations of the microstructure. We assess the electrophysiological properties of different types of circuits over more than 50 days, including their stimulation-induced neural activity. Finally, we demonstrate the effect of magnesium chloride on the electrical activity of our iPSC circuits as a proof-of-concept for screening of neuroactive compounds.

ABSTRACT Understanding the retinogeniculate pathway in vitro can offer insights into its development and potential for future therapeutic applications. This study presents a Polydimethylsiloxane-based two-chamber system with axon guidance channels, designed to replicate unidirectional retinogeniculate signal transmission in vitro . The system enables the formation of up to 20 identical functional retinothalamic networks on a single transparent microelectrode array. Using embryonic rat retinas, we developed a model where retinal spheroids innervate thalamic targets through up to 6 mm long microfluidic channels. We found that network integrity depends on channel length, with 0.5-2 mm channels maintaining over 90 % morphological and 40 % functional integrity. A reduced network integrity was recorded in longer channels. The results indicate a notable reduction in forward spike propagation in channels longer than 4 mm. Additionally, spike conduction fidelity decreased with increasing channel length. Yet, stimulation-induced thalamic target activity remained unaffected by channel length. Finally, we assessed the impact of stimulation frequency and channel length on the sustainability of the thalamic target spheroid response. The study found that a sustained thalamic calcium response could be elicited with stimulation frequencies up to 31 Hz, with higher frequencies leading to transient responses. In conclusion, this study shows how channel length affects retina to brain network formation and signal transmission in vitro .

Abstract Culturing living cells in vitro requires the maintenance of physiological conditions for extended periods of time. Here, we introduce a versatile and affordable incubation system, addressing the limitations of traditional incubation systems. Conventionally, stationary cell incubators maintain constant temperature and gas levels for in vitro cell culturing. Combining such incubators with additional lab equipment proves challenging. The presented platform offers modularity and adaptability, enabling customization to diverse experimental needs. The system includes a main unit with a user-friendly interface as well as an interchangeable incubation chamber. We present two incubation chambers targeting two completely different use cases. The first chamber, named “inkugo” facilitates the transportation of cells for up to two hours without external power and for more than a day without an external CO 2 source. The second chamber termed “inkubox” was designed to enable continuous electrophysiological recordings. Recordings from up to four neural cultures growing on high-density microelectrode arrays can be performed in parallel. The system’s unique feature lies in its separability of control and incubation components, allowing one control unit to manage various custom chambers. The design’s simplicity and the use of widely accessible components make the here proposed incubation system replicable for any laboratory. This platform fosters collaboration and experimentation in both decentralized and traditional laboratory settings, making it an invaluable addition to any cell culturing pipeline. Specifications table

Abstract The layered architecture of cortex is thought to play a fundamental role in shaping cortical computations. However, direct electrophysiological measurements of layered activity are not possible non-invasively in humans. Recent advances have shown that a distinction of two layers can be achieved using magnetoencephalography in combination with head casts and advanced spatial modeling. In this technical note, we present a dynamic causal model of a single cortical microcircuit that models event related potentials. The model captures the average dynamics of a detailed two layered circuit. It combines a temporal model of neural dynamics with a spatial model of a layer specific lead field to facilitate layer separation. In simulations we show that the spatial arrangement of the two layers can be successfully recovered using Bayesian inference. The layered model can also be distinguished from a single dipole model. We conclude that precision magnetoencephalography in combination with detailed dynamical system modeling can be used to study non-invasively the fast dynamics of layered computations.

ABSTRACT In bottom-up neuroscience, questions on neural information processing are addressed by engineering small but reproducible biological neural networks of defined network topology in vitro . The network topology can be controlled by culturing neurons within polydimethylsiloxane (PDMS) microstructures that are combined with microelectrode arrays (MEAs) for electric access to the network. However, currently used glass MEAs are limited to 256 electrodes and pose a limitation to the spatial resolution as well as the design of more complex microstructures. The use of high density complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) MEAs greatly increases the spatiotemporal resolution, enabling sub-cellular readout and stimulation of neurons in defined neural networks. Unfortunately, the non-planar surface of CMOS MEAs complicates the attachment of PDMS microstructures. To overcome the problem of axons escaping the microstructures through the ridges of the CMOS MEA, we stamp-transferred a thin film of hexane-diluted PDMS onto the array such that the PDMS filled the ridges at the contact surface of the microstructures without clogging the axon guidance channels. Moreover, we provide an impedance-based method to visualize the exact location of the microstructures on the MEA and show that our method can confine axonal growth within the PDMS microstructures. Finally, the high spatiotemporal resolution of the CMOS MEA enabled us to show that we can guide action potentials using the unidirectional topology of our circular multi-node microstructure.

Abstract The segmentation of images is a common task in a broad range of research fields. To tackle increasingly complex images, artificial intelligence (AI) based approaches have emerged to overcome the shortcomings of traditional feature detection methods. Owing to the fact that most AI research is made publicly accessible and programming the required algorithms is now possible in many popular languages, the use of such approaches is becoming widespread. However, these methods often require data labeled by the researcher to provide a training target for the algorithms to converge to the desired result. This labeling is a limiting factor in many cases and can become prohibitively time consuming. Inspired by Cycle-consistent Generative Adversarial Networks’ (cycleGAN) ability to perform style transfer, we outline a method whereby a computer generated set of images is used to segment the true images. We benchmark our unsupervised approach against a state-of-the-art supervised cell-counting network on the VGG Cells dataset and show that it is not only competitive but can also precisely locate individual cells. We demonstrate the power of this method by segmenting bright-field images of cell cultures, a live-dead assay of C.Elegans and X-ray-computed tomography of metallic nanowire meshes.

Abstract T cells sense and respond to their local environment at the nanoscale by forming small actin-rich protrusions, called microvilli, which play critical roles in signaling and antigen recognition, particularly at the interface with the antigen presenting cells. However, the mechanisms by which microvilli contribute to cell signaling and activation is largely unknown. Here, we present a tunable engineered system that promotes microvilli formation and T cell signaling via physical stimuli. We discovered that nanoporous surfaces favored microvilli formation, and markedly altered gene expression in T cells and promoted their activation. Mechanistically, confinement of microvilli inside of nanopores leads to size-dependent sorting of membrane-anchored proteins, specifically segregating CD45 phosphatases and T cell receptors (TCR) from the tip of the protrusions when microvilli are confined in 200 nm pores, but not in 400 nm pores. Consequently, formation of TCR nanoclustered hotspots within 200 nm pores, allows sustained and augmented signaling that prompts T cell activation even in the absence of TCR agonists. The synergistic combination of mechanical and biochemical signals on porous surfaces presents a straightforward strategy to investigate the role of microvilli in T cell signaling as well as to boost T cell activation and expansion for application in the growing field of adoptive immunotherapy.

Abstract Restoring functional vision in blind patients lacking a healthy optic nerve requires bypassing retinal circuits, ideally, by directly stimulating the visual thalamus. However, available deep brain stimulation electrodes do not provide the resolution required for vision restoration. We developed an implantable biohybrid nerve model designed for synaptic stimulation of deep brain targets. The interface combines a stretchable stimulation array with an aligned microfluidic axon guidance system seeded with neural spheroids to facilitate the development of a 3 mm long nerve-like structure. A bioresorbable hydrogel nerve conduit was used as a bridge between the tissue and the biohybrid implant. We demonstrated stimulation of spheroids within the biohybrid structure in vitro and used high-density CMOS microelectrode arrays to show faithful activity conduction across the device. Finally, implantation of the biohybrid nerve onto the mouse cortex showed that neural spheroids grow axons in vivo and remain functionally active for more than 22 days post-implantation.