The structure of tobacco mosaic virus (TMV) has been determined by fiber diffraction methods at 2.9 A resolution, and refined by restrained least-squares to an R-factor of 0.096. Protein-nucleic acid interactions are clearly visible. The final model contains all of the non-hydrogen atoms of the RNA and the protein, 71 water molecules, and two calcium-binding sites. Viral disassembly is driven by electrostatic repulsions between the charges in two carboxyl-carboxylate pairs and a phosphate-carboxylate pair. The phosphate-carboxylate pair and at least one of the carboxyl-carboxylate pairs appear to be calcium-binding sites. Nucleotide specificity, enabling TMV to recognize its own RNA by a repeating pattern of guanine residues, is provided by two guanine-specific hydrogen bonds in one of the three base-binding sites.

X-ray fiber diffraction analysis of tobacco mosaic virus (TMV) has led to the building of a molecular model of the intact virus, based on a map at 3.6 Å resolution derived from five separated Bessel orders. This has been made possible by advances in the solution of the fiber diffraction phase problem. It is now possible to understand much of the chemical basis of TMV assembly, particularly in terms of intersubunit electrostatic interactions and RNA binding. Consideration of the molecular structure in conjunction with physical chemical studies by several groups of investigators suggests that the nucleating aggregate for initiation of TMV assembly is a short (about two turns) helix of protein subunits, probably inhibited from further polymerization in the absence of RNA by the disordering of a peptide loop near the inner surface of the virus.

ABSTRACT Spiroplasma , which are known pathogens and commensals of arthropods and plants, are helical-shaped bacteria that lack a peptidoglycan layer. Spiroplasma swim by alternating between left- and right-handed helicity. Of note, this system is not related to flagellar motility, which is widespread in bacteria. A helical ribbon running along the inner side of the helical cell should be responsible for cell helicity and comprises the bacterial actin homolog, MreB, and a protein specific to Spiroplasma , fibril. Here, we isolated the ribbon and its major component, fibril filament, for electron microscopy (EM) analysis. Single-particle analysis of the fibril filaments using the negative-staining EM revealed a three-dimensional chain structure composed of rings with a size of 11 nm wide and 6 nm long, connected by a backbone cylinder with an 8.7 nm interval with a twist along the filament axis. This structure was verified through EM tomography of quick-freeze deep-etch replica sample, with a focus on its handedness. The handedness and pitch of the helix for the isolated ribbon and fibril filament agreed with those of the cell in the resting state. Structures corresponding to the alternative state were not identified. These results suggest that the helical cell structure is supported by fibril filaments; however, the helical switch is caused by the force generated by the MreB proteins. The isolation and structural outline of the fibril filaments provide crucial information for an in-depth clarification of the unique swimming mechanism of Spiroplasma .

Abstract The bacterial flagellar MS ring is a transmembrane complex acting as the core of the flagellar motor. It not only acts as the template for rod and C ring assembly but also houses the type III protein export gate for assembly of the rod, hook and filament. The cytoplasmic C ring, involved in torque generation and rotation switch, is directly attached to the MS ring, and a symmetry mismatch between 26-fold MS ring and 34-fold C ring had been a long puzzle as to whether this would play some role in motor function. Although this puzzle seemed to have been resolved by the recent high-resolution structure of the MS ring with 33-fold symmetry with a variation from 32-fold to 35-fold because the C ring also shows a similar symmetry variation, it still remained ambiguous whether their symmetries are matched in the native motor structure. Here we show that the native MS ring structure formed by full-length FliF is 34-fold with no symmetry variation whereas the C ring has a small symmetry variation, indicating a flexibility in C ring assembly to generate small symmetry mismatches. We also show two conformations of FliF in part of its periplasmic region to form the 34-subunit ring with 23-fold and 11-fold subsymmetries in the inner and middle M ring, respectively, to accommodate the export gate at the center of the M ring.

Abstract Many specimens suffer from low particle density and/or preferred orientation in cryoEM specimen grid preparation, making data collection and structure determination time consuming. We developed an epoxidized graphene grid (EG-grid) that effectively immobilizes protein particles by applying an oxidation reaction using photoactivated ClO 2 • and further chemical modification. The particle density and orientation distribution are both dramatically improved, having enabled us to reconstruct the density map of GroEL and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), at 1.99 and 2.16 Å resolution from only 504 and 241 micrographs, respectively. A low concentration sample solution of 0.1 mg ml −1 was sufficient to reconstruct a 3.10 Å resolution density map of SARS-CoV-2 spike protein from 1,163 micrographs. The density maps of V 1 -ATPase, β-galactosidase, and apoferritin were also reconstructed at 3.03, 1.81, and 1.29 Å resolution, respectively. These results indicate that the EG-grid will be a powerful tool for high-throughput cryoEM data collection to accelerate high-resolution structural analysis of biological macromolecules.

Abstract The bacterial flagellum is a motility organelle, consisting of the basal body acting as a rotary motor, the filament as a helical propeller and the hook connecting these two as a universal joint 1,2 . The basal body contains three rings: the MS ring as the transmembrane core of the rotor; the C ring essential for torque generation and switching regulation; and the LP ring as a bushing supporting the distal rod for its rapid, stable rotation without much friction. The negatively charged surface of the distal rod suggested electrostatic repulsive force in supporting high-speed rotation of the rod as a drive shaft 3 , but the LP ring structure was needed to see the actual mechanisms of its bushing function and assembly against the repulsive force. Here we report the LP ring structure by electron cryomicroscopy at 3.5 Å resolution, showing 26-fold rotational symmetry and intricate intersubunit interactions of each subunit with up to six partners that explains the structural stability. The inner surface is charged both positively and negatively, and positive charges on the P ring presumably play important roles in its initial assembly around the rod in the peptidoglycan layer followed by the L ring assembly in the outer membrane.