Developmental processes in multicellular organisms, and the outcomes they produce, are often evolutionarily conserved. Yet phylogenetic conservation of developmental outcomes is not reflected in functional preservation of the genes regulating these processes, a phenomenon referred to as developmental system drift (1, 2). Little is known about the evolutionary forces producing change in the molecular details of regulatory genes and their networks while preserving development outcomes. Here we address this void in knowledge by systematically swapping the Drosophila melanogaster coding and noncoding regions of the essential gap gene, giant , a key regulator of embryonic pattern formation, with orthologous sequences drawn from both closely and distantly related species within the genus. Employing sensitized genetic complementation assays, the loss of a transgene’s ability to restore viability occurs across phylogeny at every interspecific level of comparison and includes both coding and noncoding changes. Epistasis is present as well — both between coding and noncoding sequences and, in a dramatic example of change-of-sign epistasis, between the only two coding substitutions separating two very closely related species. A continuous process of functional divergence hidden under conserved phylotypic developmental outcomes requires reconsideration of the prevailing view that the essential genes in conserved regulatory networks are protected from the driving forces of evolutionary change.

Sleep-wake dysfunction is an early and common event in Alzheimer's disease (AD). The lateral hypothalamic area (LHA) regulates the sleep and wake cycle through wake-promoting orexinergic neurons (OrxN) and sleep-promoting melanin-concentrating hormone or MCHergic neurons (MCHN). These neurons share close anatomical proximity with functional reciprocity. This study investigated LHA OrxN and MCHN loss patterns in AD individuals. Understanding the degeneration pattern of these neurons will be instrumental in designing potential therapeutics to slow down the disease progression and remediate the sleep-wake dysfunction in AD.

Hypercalcemia, caused by tumor secretion of parathyroid hormone-related protein (PTHrP), is associated with anorexia and weight loss. We demonstrate that overexpression of PTHrP by tumor cells in a transgenic model of breast cancer causes anorexia and rapid weight loss. These changes are accompanied by activation of neurons in the area postrema (AP), the nucleus tractus solitarius (NTS) and the parabrachial nucleus (PBN), a hindbrain circuit regulating food intake. Blocking hypercalcemia prevents anorexia and activation of these brain centers in tumor bearing mice, whereas injecting calcium activates the same circuit in wild-type mice. Neurons in the AP express the calcium-sensing receptor (CaSR) and the same AP/NTS/PBN circuit is stimulated by treating WT mice with cinacalcet, an allosteric activator of the CaSR. Finally, treating diet-induced obese mice with cinacalcet reduces food intake and causes weight loss. These results suggest that CaSR-expressing neurons in the AP might be a pharmacologic target for obesity.

The most common known cause of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) is a hexanucleotide repeat expansion (HRE) in C9ORF72 that contributes to neurodegeneration by both loss-of-function (decreased C9ORF72 protein levels) and gain-of-function (e.g. dipeptide repeat protein production) mechanisms. Although therapeutics targeting the gain-of-function mechanisms are in clinical development, it is unclear if these will be efficacious given the contribution of C9ORF72 loss-of-function processes to neurodegeneration. Moreover, there is a lack of therapeutic strategies for C9ORF72 ALS/FTD with demonstrated efficacy in vivo. Here, we show that small molecule inhibition of PIKFYVE kinase rescues both loss- and gain-of-function C9ORF72 disease mechanisms in vivo. We find that the reduction of C9ORF72 in mouse motor neurons leads to a decrease in early endosomes. In contrast, treatment with the PIKFYVE inhibitor apilimod increases the number of endosomes and lysosomes. We show that reduced C9ORF72 levels increases glutamate receptor levels in hippocampal neurons in mice, and that apilimod treatment rescues this excitotoxicity-related phenotype in vivo. Finally, we show that apilimod also alleviates the gain-of-function pathology induced by the C9ORF72 HRE by decreasing levels of dipeptide repeat proteins derived from both sense and antisense C9ORF72 transcripts in hippocampal neurons in vivo. Our data demonstrate the neuroprotective effect of PIKFYVE kinase inhibition in both gain- and loss-of-function murine models of C9ORF72 ALS/FTD.

Abstract Drugs acting as positive allosteric modulators (PAMs) to enhance the activation of the calcium sensing receptor (CaSR) and to suppress parathyroid hormone (PTH) secretion can treat hyperparathyroidism but suffer from side effects including hypocalcemia and arrhythmias. Seeking new CaSR modulators, we docked libraries of 2.7 million and 1.2 billion molecules against transforming pockets in the active-state receptor dimer structure. Consistent with simulations suggesting that docking improves with library size, billion-molecule docking found new PAMs with a hit rate that was 2.7-fold higher than the million-molecule library and with hits up to 37-fold more potent. Structure-based optimization of ligands from both campaigns led to nanomolar leads, one of which was advanced to animal testing. This PAM displays 100-fold the potency of the standard of care, cinacalcet, in ex vivo organ assays, and reduces serum PTH levels in mice by up to 80% without the hypocalcemia typical of CaSR drugs. Cryo-EM structures with the new PAMs show that they induce residue rearrangements in the binding pockets and promote CaSR dimer conformations that are closer to the G-protein coupled state compared to established drugs. These findings highlight the promise of large library docking for therapeutic leads, especially when combined with experimental structure determination and mechanism. One sentence summary Structure-based virtual screening uncovers novel CaSR allosteric modulators with enhanced efficacy and less side effects.

ABSTRACT Evolved changes within species lead to the inevitable loss of viability in hybrids. Inviability is also a convenient phenotype to genetically map and validate functionally divergent genes and pathways differentiating closely related species. Here we identify the Drosophila melanogaster form of the highly conserved essential gap gene giant ( gt ) as a key genetic determinant of hybrid inviability in crosses with D. santomea . We show that the coding region of this allele in D. melanogaster/D. santomea hybrids is sufficient to cause embryonic inviability not seen in either pure species. Further genetic analysis indicates that tailless ( tll ), another gap gene, is also involved in the hybrid defects. giant and tll are both members of the gap gene network of transcription factors that participate in establishing anterior-posterior specification of the dipteran embryo, a highly conserved developmental process. Genes whose outputs in this process are functionally conserved nevertheless evolve over short timescales to cause inviability in hybrids.

Plant NLR resistance genes provide some of the most extreme examples of polymorphism in eukaryotic genomes, rivalling even the vertebrate major histocompatibility complex. Surprisingly, this is also true in Arabidopsis thaliana , a predominantly selfing species with low heterozygosity. Here, we investigate how gene duplication and intergenic exchange contribute to this extraordinary variation. RPP8 is a three-locus system that is configured chromosomally as either a direct-repeat tandem duplication or as a single copy locus, plus a locus 2 Mb distant. We sequenced 48 RPP8 alleles from 37 accessions of A. thaliana and 12 RPP8 alleles from A. lyrata to investigate the patterns of interlocus shared variation. The tandem duplicates display fixed differences and share less variation with each other than either shares with the distant paralog. A high level of shared polymorphism among alleles at one of the tandem duplicates, the single-copy locus and the distal locus, must involve both classical crossing over and intergenic gene conversion. Despite these polymorphism-enhancing mechanisms, the observed nucleotide diversity could not be replicated under neutral forward-in-time simulations. Only by adding balancing selection to the simulations do they approach level of polymorphism observed at RPP8 . In this NLR gene triad, genetic architecture, gene function and selection all combine to generate diversity.

Abstract Structural defects in cilia have robust effects in diverse tissues and systems. However, how ciliary length changes influence signaling output are unknown. Here, we examined the functional role of a ciliary length control mechanism whereby FBW7-mediated destruction of NDE1 positively regulated ciliary length, in mesenchymal stem cell differentiation. We show that FBW7 functions as a master regulator of both negative (NDE1) and positive (TALPID3) regulators of ciliogenesis, with an overall positive net effect on cilia formation, MSC differentiation, and bone architecture. Deletion of Fbxw7 suppresses ciliation, Hedgehog activity, and differentiation, which are rescued in Fbxw7/Nde1 -null cells. However, despite formation of abnormally long cilia in Nde1 -null cells, MSC differentiation is suppressed. NDE1 promotes MSC differentiation by increasing the activity of the Hedgehog pathway by direct binding and enhancing GLI2 activity in a cilia-independent manner. We propose that ciliary structure-function coupling is determined by intricate interactions of structural and functional proteins.

Abstract Individuals with Alzheimer’s Disease (AD) experience circadian rhythm disorder. The circadian rhythm is synchronized by a master clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN), which is a tiny hypothalamic nucleus. Little is known about the molecular and pathological changes that occur in the SCN during AD progression. We examined postmortem brains of 12 controls without AD neuropathological changes (Braak stage 0) and 36 subjects at progressive Braak stages (I, II, and VI). To investigate potential AD-specific changes, we measured the neuronal counts of arginine vasopressin (AVP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) positive neurons, along with the Braak stages in the SCN. We investigated in adjacent hypothalamic nuclei which are also composed of AVP+ neurons but show more resilience to AD: paraventricular nucleus (PVN) and supraoptic nucleus (SON). To understand the dysregulated proteins associated to AD progression, we performed in-situ proteomics, investigating 57 proteins, including commonly dysregulated in AD, using GeoMx Digital Spatial Profiling (DSP) in the three nuclei (total of 703 area of interests). Neurofibrillary tangles (NFTs) and tau fibrils were found selectively in SCN. We failed to detect NFTs in SON, only a mild dysregulation of p-tau at Braak VI in PVN and SON. Amyloid plaque was absent in the SCN and SON. Additionally, the SCN showed increased glial proteins already at Braak stage I, whereas the level of these proteins sustained in the other nuclei. The SCN is exclusively vulnerable to AD-tau pathology and show immune dysregulation even at Braak I but is protected against amyloid plaque. This finding revealed selectively in amnestic AD, showing more resilience in AD variant. This tau-related molecular dysregulation in the SCN contributes to circadian rhythm disturbances in AD, a phenomenon observed before the onset of cognitive disorder.

Abstract Increasing extracellular [Ca 2+ ] ([Ca 2+ ] o ) strongly decreases intrinsic excitability in neurons but the mechanism is unclear. By one hypothesis, [Ca 2+ ] o screens surface charge reducing voltage-dependent sodium channel (VGSC) activation and by another [Ca 2+ ] o activates Calcium-sensing receptor (CaSR) closing the sodium-leak channel (NALCN). Here we report that action potential (AP) firing rates increased in wild-type (WT), but not CaSR null mutant (Casr-/-) neocortical neurons, following the switch from physiological to reduced Ca 2+ -containing Tyrode. However, after membrane potential correction, AP firing increased similarly in both genotypes inconsistent with CaSR regulation of NALCN. Activation of VGSCs was the dominant contributor to the increase in excitability after the [Ca 2+ ] o change. VGSC conductance-voltage relationships were hyperpolarized by decreasing [Ca 2+ ] o for Casr-/- neurons indicating CaSR contributes to [Ca 2+ ] o -dependent excitability via VGSCs. Regulation of VGSC gating by [Ca 2+ ] o is the key mechanism mediating [Ca 2+ ] o -dependent changes in neocortical neuron excitability and CaSR influences neuronal excitability by its effects on VGSC gating.