Abstract Previous studies demonstrated that acute, exercise-induced fatigue transiently reduces whole-muscle stiffness. Because reduced muscle stiffness at fatigue may contribute to increased injury risk and impaired contractile performance, the present study seeks to elucidate potential intracellular mechanisms underlying these reductions. To that end, cellular passive Young’s Modulus was measured in single, permeabilized muscle fibers from healthy, recreationally-active males and females. Eight volunteers (4 male, 4 female) completed unilateral, repeated maximal voluntary knee extensions until fatigue, after which percutaneous needle biopsies were performed on the fatigued (F) and non-fatigued (NF) Vastus Lateralis muscles. Muscle samples were processed for mechanical assessment and separately for imaging and phosphoproteomics. Single fibers were passively (pCa 8.0), incrementally stretched to 156% of the initial sarcomere length to assess Young’s Modulus, calculated as the slope of the resulting stress-strain curve at short (strain = 1.00-1.24 %Lo) and long (strain = 1.32-1.56 %Lo) fiber lengths. Titin phosphorylation was assessed by liquid chromatography followed by high-resolution mass spectrometry (LC-MS). Passive modulus was significantly reduced by fatigue at short and long lengths in male, but not female, participants. Fatigue increased phosphorylation of four serine residues located within the elastic region of titin and reduced phosphorylation at one serine residue but did not impact active tension nor sarcomere ultrastructure. Collectively, these results suggest muscle fatigue reduces cellular passive modulus in young males, but not females, concurrent with altered titin phosphorylation. These results provide mechanistic insight contributing to the understanding of sex-based differences in soft tissue injury and falls risk. Key Points Summary Previous studies have shown that skeletal muscle stiffness is reduced following a single bout of fatiguing exercise. Lower muscle stiffness at fatigue may increase risk for soft-tissue injury, however, the underlying mechanisms of this change are unclear. Our findings show that fatiguing exercise reduces passive Young’s modulus in skeletal muscle cells from males but not females, suggesting that intracellular proteins contribute to reduced muscle stiffness with fatigue in a sex-dependent manner. The phosphorylation status of the intracellular protein titin is modified by fatiguing exercise in a way that may contribute to altered muscle stiffness after fatiguing exercise. These results provide important mechanistic insight that may help explain why biological sex impacts risk for soft tissue injury in with repeated or high intensity mechanical loading in athletes and falls risk in older adults. New and Noteworthy Muscle fatigue has previously been shown to reduce musculotendinous stiffness, but the underlying mechanisms remain unclear. Our study presents novel evidence of fatigue-induced reductions in passive cellular Young’s Modulus in skeletal muscle from males, but not females, in conjunction with fatigue-induced alterations in titin phosphorylation. Collectively, these results suggest that intracellular mechanisms including titin phosphorylation may contribute to altered skeletal muscle stiffness following fatiguing exercise, and that this response is mediated by biological sex.

Age-related cataract is a major cause of blindness worldwide. Yet, the molecular mechanisms whereby large, light scattering aggregates form is poorly understood, because of the complexity of the aggregates isolated from human lenses. The predominant proteins in the lens are structural proteins called crystallins. The γS-crystallin is heavily modified in cataractous lenses by deamidation, which introduces a negative charge at labile asparagine residues. The effects of deamidation at asparagines, N14, N76, and N143, were mimicked by replacing the asparagine with aspartate using site-directed mutagenesis. The effects of these surface deamidations on the stability, unfolding, and aggregation properties of γS were determined using dynamic light scattering, chemical and thermal-denaturation, and hydrogen-deuterium exchange with mass spectrometry. We found that a small population of all the deamidation mimics aggregated directly into large light scattering bodies with a radius greater than 10 nm that contributed 14-60% of the total scattering intensity compared to 7% for WT under the same conditions. A possible mechanism was identified under partially denaturing conditions, where deamidation led to significantly more rapid unfolding and aggregation particularly for N76D compared to WT. The triple mutant was further destabilized, reflecting the enhanced aggregation properties of N14D and N143D. Thus, the effects of deamidation were both site-specific and cumulative. αA-crystallin was ineffective at acting as a chaperone to prevent the aggregation of destabilized, deamidated γS. It is concluded that surface deamidations, while causing minimal structural disruption individually, progressively destabilize crystallin proteins, leading to their unfolding and precipitation in aged and cataractous lenses.

Sensory hair cells require control of physical properties of their apical plasma membranes for normal development and function. Members of the ARF small GTPase family regulate membrane trafficking and cytoskeletal assembly in many cells. We identified ELMOD1, a guanine nucleoside triphosphatase activating protein (GAP) for ARF6, as the most highly enriched ARF regulator in hair cells. To characterize ELMOD1 control of trafficking, we used a mouse strain lacking functional ELMOD1 (roundabout; rda). In rda/rda mice, cuticular plates of utricle hair cells initially formed normally, then degenerated after postnatal day 5 (P5); large numbers of vesicles invaded the compromised cuticular plate. Hair bundles initially developed normally, but the cell's apical membrane lifted away from the cuticular plate, and stereocilia elongated and fused. Membrane trafficking in type I hair cells, measured by FM1-43 dye labeling, was altered in rda/rda mice. Consistent with the proposed GAP role for ELMOD1, the ARF6 GTP/GDP ratio was significantly elevated in rda/rda utricles as compared to controls, and the level of ARF6-GTP was correlated with the severity of the rda/rda phenotype. These results suggest that conversion of ARF6 to its GDP-bound form is necessary for final stabilization of the hair bundle.

Abstract Clear cell sarcoma of soft tissue (CCSST) is an ultra-rare sarcoma with poor prognosis presently with no cure. It is characterized by a balanced t(12;22) (q13;q12) chromosomal translocation, resulting in a fusion of the Ewing’s sarcoma gene EWSR1 with activating transcription factor 1 ( ATF1 ) to give an oncogene EWSR1-ATF1 . Unlike normal ATF1, whose transcription activity is dependent on phosphorylation, EWSR1-ATF1 is constitutively active to drive ATF1-dependent gene transcription to cause tumorigenesis. No EWSR1-ATF1-targeted therapies have been identified due to the challenges in targeting intracellular transcription factors. To identify potential druggable targets for CCSST, we show that protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) is a novel enzyme in enhancing EWSR1-ATF1-mediated gene transcription to sustain CCSST cell proliferation. Genetic silencing of PRMT5 in CCSST cells resulted in severely impaired cell proliferation and EWSR1-ATF1-driven transcription. Furthermore, the clinical-stage PRMT5 inhibitor JNJ-64619178 potently and efficaciously inhibited CCSST cell growth in vitro and in vivo . These results provide new insights into PRMT5 as a transcription regulator and warrant JNJ-64619178 for further clinical development to treat CCSST patients.

ATP-sensitive potassium (KATP) channels composed of a pore-forming Kir6.2 potassium channel and a regulatory ABC transporter sulfonylurea receptor 1 (SUR1) regulate insulin secretion in pancreatic β-cells to maintain glucose homeostasis. Mutations that impair channel folding or assembly prevent cell surface expression and cause congenital hyperinsulinism. Structurally diverse KATP inhibitors have been shown to act as pharmacochaperones to correct mutant channel expression, but the mechanism is unknown. Here, we compare cryoEM structures of KATP channels bound to pharmacochaperones glibenclamide, repaglinide, and carbamazepine. We found all three drugs bind within a common pocket in SUR1. Further, we found the N-terminus of Kir6.2 inserted within the central cavity of the SUR1 ABC core, adjacent the drug binding pocket. The findings reveal a common mechanism by which diverse compounds stabilize the Kir6.2 N-terminus within the SUR1 ABC core, allowing it to act as a firm "handle" for the assembly of metastable mutant SUR1-Kir6.2 complexes.

Deamidation is a major age-related modification in the human lens that is highly prevalent in crystallins isolated from cataractous lenses. However, the mechanism by which deamidation causes proteins to become insoluble is not known, because of only subtle structural changes observed in vitro. We have identified Asn14 and Asn76 of γS-crystallin as highly deamidated in insoluble proteins. These sites are on the surface of the N-terminal domain and were mimicked by replacing the Asn with Asp residues. We used heteronuclear NMR spectroscopy to measure their amide hydrogen exchange and 15N relaxation dynamics to identify regions with significantly increased dynamics compared to wildtype-γS. Changes in dynamics were localized to the C-terminal domain, particularly to helix and surface loops distant from the mutation sites. Thus, a potential mechanism for γS deamidation-induced insolubilization in cataractous lenses is altered dynamics due to local regions of unfolding and increased flexibility rather than global structural changes.

Abstract The α-crystallin small heat shock proteins contribute to the transparency and refractive properties of the vertebrate eye lens and prevent the protein aggregation that would otherwise produce lens cataracts, the leading cause of human blindness. There are conflicting data in the literature as to what role the α-crystallins may play in early lens development. In this study, we used CRISPR gene editing to produce zebrafish lines with null mutations for each of the three α-crystallin genes ( cryaa, cryaba and cryabb ). The absence of normal protein was confirmed by mass spectrometry, and lens phenotypes were assessed with differential interference contrast microscopy and histology. Loss of αA-crystallin produced a variety of lens defects with varying severity in larval lenses at 3 and 4 dpf but little substantial change in normal fiber cell denucleation. Loss of either αBa- or full-length αBb-crystallin produced no substantial lens defects. Mutation of each α-crystallin gene did not alter the mRNA levels of the remaining two, suggesting a lack of genetic compensation. These data confirm a developmental role for αA-crystallin in lens development, but the range of phenotype severity suggests that its loss simply increases the chance for defects and that the protein is not essential. Our finding that cryaba and cryabb mutants lack noticeable lens defects is congruent with insubstantial transcript levels in lens epithelial and fiber cells. Future experiments can explore the molecular consequences of cryaa mutation and causes of lens defects in this null mutant, as well as the roles of other genes in lens development and function.