Abstract Several empirical and theoretical studies suggest presence of multiple enhancers per gene that collectively regulate gene expression, and that common sequence variation impacting on the activities of these enhancers is a major source of inter-individual variability in gene expression. However, for vast majority of genes, enhancers and the underlying regulatory variation remains unknown. Even for the genes with well-characterized enhancers, the nature of the combined effects from multiple enhancers and their variants, when known, on gene expression regulation remains unexplored. Here, we have evaluated the combined effects from five SCN5A enhancers and their regulatory variants that are known to collectively correlate with SCN5A cardiac expression and underlie QT interval association in the general population. Using small deletions centered at the regulatory variants in episomal reporter assays in a mouse cardiomyocyte cell line we demonstrate that the variants and their flanking sequences play critical role in individual enhancer activities, likely being a transcription factor (TF) binding site. By performing oligonucleotide-based pulldown assays on predicted TFs we identify the TFs likely driving allele-specific enhancer activities. Using all 32 possible allelic synthetic constructs in reporter assays, representing the five biallelic enhancers in tandem in their genomic order, we demonstrate combined additive effects on overall enhancer activities. Using transient enhancer assays in developing zebrafish embryos we demonstrate the four out the five enhancer elements act as enhancers in vivo . Together, these studies extend the previous findings to uncover the TFs driving the enhancer activities of QT interval associated SCN5A regulatory variants, reveal the additive effects from allelic combinations of these regulatory variants, and prove their potential to act as enhancers in vivo .

Abstract Genome-wide association studies (GWAS) of QT interval variation have identified common noncoding variants at the NOS1AP gene as the most common genetic regulators of trait variation in the general population. Invoking a cis -regulatory mechanistic hypothesis, we have reported identification of a functional enhancer variant underlying the GWAS signal that influenced human cardiac NOS1AP expression. Functional studies based on in vitro overexpression in murine cardiomyocytes and ex vivo knockdown in zebrafish embryonic hearts, by us and others, have demonstrated that NOS1AP expression levels can alter cellular electrophysiology. Here, to explore the role of NOS1AP in cardiac electrophysiology at an organismal level, we generated and characterized constitutive and heart muscle-restricted Nos1ap knockout mice to assess whether NOS1AP disruption alters the QT interval in vivo . Constitutive loss of Nos1ap led to genetic background-dependent variable lethality at or right before birth. Heart muscle-restricted Nos1ap knockouts generated using cardiac specific alpha-myosin heavy chain promoter-driven tamoxifen-inducible Cre resulted in tissue-level Nos1ap expression reduced by half. This partial loss of expression had no detectable effect on the QT interval, but led to a small yet significant reduction in the QRS interval. Given that challenges associated with defining the end of T wave on murine electrocardiogram can limit identification of subtle effects on QT interval, and that common noncoding NOS1AP variants are also associated with QRS interval, our findings support the role of NOS1AP in regulation of the cardiac electrical cycle.