By means of in vivo selection, transcriptomic analysis, functional verification and clinical validation, here we identify a set of genes that marks and mediates breast cancer metastasis to the lungs. Some of these genes serve dual functions, providing growth advantages both in the primary tumour and in the lung microenvironment. Others contribute to aggressive growth selectively in the lung. Many encode extracellular proteins and are of previously unknown relevance to cancer metastasis. Much research in breast cancer is aimed at identifying tumour subtypes that influence clinical outcome. One such study has identified a series of genes that mediate breast carcinoma metastasis to the lung but not other organs. Poor-prognosis patients with this gene signature fare much worse than other poor-prognosis patients. The data suggest that a subset of these genes mediates growth of the primary breast tumours and of the metastases in the lung, while a second subset provides virulence at the metastatic site without enhancing primary tumour growth. These genes are potential targets for administered inhibitors.

We investigated the molecular basis for osteolytic bone metastasis by selecting human breast cancer cell line subpopulations with elevated metastatic activity and functionally validating genes that are overexpressed in these cells. These genes act cooperatively to cause osteolytic metastasis, and most of them encode secreted and cell surface proteins. Two of these genes, interleukin-11 and CTGF, encode osteolytic and angiogenic factors whose expression is further increased by the prometastatic cytokine TGFβ. Overexpression of this bone metastasis gene set is superimposed on a poor-prognosis gene expression signature already present in the parental breast cancer population, suggesting that metastasis requires a set of functions beyond those underlying the emergence of the primary tumor.

We have examined whether the extracellular matrix is a biochemical target for transforming growth factor-beta (TGFbeta). We find that TGFbeta increases the expression of the major extracellular matrix proteins, fibronectin and collagen. This effect is a general response to TGFbeta seen in primary cultures and established lines of cells from various types, normal and transformed. The relative incorporation of fibronectin and collagen into the matrix also increases in response to TGFbeta. The effect of TGFbeta on fibronectin levels as characterized in chick embryo fibroblasts is rapid, selective, persistent, and specific, and involves transcriptional events; it is not mimicked by other growth factors tested. The induction of anchorage-independent growth of normal fibroblasts by TGFbeta is mimicked by fibronectin and is specifically blocked by inhibitors of fibronectin binding to its cell surface receptor. The results demonstrate a functional involvement of fibronectin in mediating cellular responses to TGFbeta, and suggest a model for TGFbeta action based on the control of the extracellular matrix in target cells.

We cloned P27Kip1, a cyclin-dependent kinase inhibitor implicated in G1 phase arrest by TGFβ and cell-cell contact. p27Kip1 associates with cyclin E-Cdk2 complexes in vivo and in vitro, prevents their activation, and inhibits previously activated complexes, and p27Kip1 overexpression obstructs cell entry into S phase. p27Kip1 potently inhibits Rb phosphorylation by cyclin E-Cdk2, cyclin A-Cdk2, and cyclin D2-Cdk4. p27Kip1 is highly conserved and broadly expressed in human tissues, and its mRNA levels are similar in proliferating and quiescent cells. p27Kip1 has a region of sequence similarity to p21Cip1/WAF1, the Cdk inhibitor whose transcription is stimulated by p53. A p27Kip1 peptide corresponding to this region retains Cdk inhibitory activity. We suggest that cell contact, TGFβ, and p53 all restrain cell proliferation through related Cdk inhibitors.

Cell-cell contact and TGF-beta can arrest the cell cycle in G1. Mv1Lu mink epithelial cells arrested by either mechanism are incapable of assembling active complexes containing the G1 cyclin, cyclin E, and its catalytic subunit, Cdk2. These growth inhibitory signals block Cdk2 activation by raising the threshold level of cyclin E necessary to activate Cdk2. In arrested cells the threshold is set higher than physiological cyclin E levels and is determined by an inhibitor that binds to cyclin E-Cdk2 complexes. A 27-kD protein that binds to and prevents the activation of cyclin E-Cdk2 complexes can be purified from arrested cells but not from proliferating cells, using cyclin E-Cdk2 affinity chromatography. p27 is present in proliferating cells, but it is sequestered and unavailable to interact with cyclin E-Cdk2 complexes. Cyclin D2-Cdk4 complexes bind competitively to and down-regulate the activity of p27 and may thereby act in a pathway that reverses Cdk2 inhibition and enables G1 progression.

A search for general regulators of cancer metastasis has yielded a set of microRNAs for which expression is specifically lost as human breast cancer cells develop metastatic potential. Here we show that restoring the expression of these microRNAs in malignant cells suppresses lung and bone metastasis by human cancer cells in vivo. Of these microRNAs, miR-126 restoration reduces overall tumour growth and proliferation, whereas miR-335 inhibits metastatic cell invasion. miR-335 regulates a set of genes whose collective expression in a large cohort of human tumours is associated with risk of distal metastasis. miR-335 suppresses metastasis and migration through targeting of the progenitor cell transcription factor SOX4 and extracellular matrix component tenascin C. Expression of miR-126 and miR-335 is lost in the majority of primary breast tumours from patients who relapse, and the loss of expression of either microRNA is associated with poor distal metastasis-free survival. miR-335 and miR-126 are thus identified as metastasis suppressor microRNAs in human breast cancer. Recent studies have highlighted global downregulation of microRNAs in cancers, and have shown that artificial downregulation of all microRNAs can enhance tumour growth. Array-based microRNA profiling of human breast cancer cells that are metastatic to bone and lung now implicates two microRNAs, miR-126 and miR-335, in breast cancer tumorigenesis and metastasis. Loss of miR-335 expression promotes breast cancer cell invasion by targeting the transcription factor SOX4 and tenascin C, a protein involved in cell adhesion. In breast cancer patients, loss of miR-126 and miR-335 expression is indicative of a poor prognosis. The microRNAs miR-126 and miR-335 have an important role in breast cancer tumourigenesis and metastasis. Loss of miR-335 expression promotes breast cancer cell invasion by targeting SOX4 and tenascin C. In breast cancer patients, loss of miR-126 and miR-335 expression is indicative of a poor prognosis.

Little is known about the mechanisms by which breast cancer cells metastasize to the brain. Bos et al. now identify three genes that are involved in this process. COX2 and HBEGF have previously been shown to also mediate breast cancer metastasis to the lung, suggesting common biological processes that regulate dissemination to these two organs. In addition, they find that ST6GALNAC5 is specifically involved in brain metastasis, by increasing the adhesion of breast cancer cells to the brain endothelium and migration through the blood–brain barrier. Little is known about the mechanisms by which breast cancer cells metastasize to the brain. By performing gene expression analysis on cells that preferentially infiltrate the brain it has now been possible to identify three genes that are involved in this process, two of which—COX2 and HBEGF—have previously been shown to mediate breast cancer metastasis to the lung. The molecular basis for breast cancer metastasis to the brain is largely unknown1,2. Brain relapse typically occurs years after the removal of a breast tumour2,3,4, suggesting that disseminated cancer cells must acquire specialized functions to take over this organ. Here we show that breast cancer metastasis to the brain involves mediators of extravasation through non-fenestrated capillaries, complemented by specific enhancers of blood–brain barrier crossing and brain colonization. We isolated cells that preferentially infiltrate the brain from patients with advanced disease. Gene expression analysis of these cells and of clinical samples, coupled with functional analysis, identified the cyclooxygenase COX2 (also known as PTGS2), the epidermal growth factor receptor (EGFR) ligand HBEGF, and the α2,6-sialyltransferase ST6GALNAC5 as mediators of cancer cell passage through the blood–brain barrier. EGFR ligands and COX2 were previously linked to breast cancer infiltration of the lungs, but not the bones or liver5,6, suggesting a sharing of these mediators in cerebral and pulmonary metastases. In contrast, ST6GALNAC5 specifically mediates brain metastasis. Normally restricted to the brain7, the expression of ST6GALNAC5 in breast cancer cells enhances their adhesion to brain endothelial cells and their passage through the blood–brain barrier. This co-option of a brain sialyltransferase highlights the role of cell-surface glycosylation in organ-specific metastatic interactions.

Transforming growth factor β (TGFβ) binds with high affinity to the type II receptor, a transmembrane protein with a cytoplasmic serine/threonine kinase domain. We show that the type II receptor requires both its kinase activity and association with another TGFβ-binding protein, the type I receptor, to signal growth inhibition and early gene responses. Receptors I and II associate as interdependent components of a heteromeric complex: receptor I requires receptor II to bind TGFβ, and receptor II requires receptor I to signal. This mode of operation points to fundamental differences between this receptor and the protein-tyrosine kinase cytokine receptors.