11538 Background: Missense variants associated with high frequency, clinical context, splicing, penetrance and biochemical function are scored as pathogenic by ClinVar/ACMG (scores >99%/>90%). Pathogenic scores that range from this cut-point to 10% (benign) are referred to as variants of unknown significance (VUS). Alphafold2 is a deep neural network algorithm for protein structure trained on known molecular structures. It has informed AlphaMissense (AM) where the impact of every possible single missense variant in the human genome is assessed. The AM continuous pathogenicity score (roughly 0-0.35 benign, 0.36-0.55 ambiguous, 0.56-1.0 pathogenic) are claimed to have 90% accuracy based on ClinVar (based on 1,263 pathogenic and 1,263 benign variants). Methods: Here, we identified VUSs from the Oxford Sarcoma Precision Oncology real world cohort. This included the identification of somatic variants from FoundationOne Heme Sarcoma analysis of Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) tumour samples. Germline variants were identified from whole exome sequencing (WES) (97 genes) from patient blood samples followed by analysis using GATK guidelines. All VUS identified were further analysed using AM. Results: AM reclassified the identified >1000 VUSs from 60 high grade sarcoma gene panels predominantly into benign or pathogenic, with only ~1% remaining as ambiguous. Variants reclassified as pathogenic were assessed for likelihood of pathogenicity based on scientific rationale. This involved evaluating current literature on the variant, determining evolutionary consensus of the residue, structural analysis to assess the potential function of the residue and enrichment of the variant within sarcoma patients compared to known frequencies across the population. Conclusions: In conclusion, the AM classifier dichotomises VUS to either benign or pathogenic, but this is not based on either structural or functional predictions directly. We conclude that it should not be currently used in the analysis of clinical samples seeking actionable variants but could instead stratify potential pathogenic variants for functional investigation.

Abstract The evolutionarily conserved TGF-β signalling pathway suppresses cell growth, yet loss of function results in cancer phenotypes. Here, we evaluate loss of the TGF-β pathway signal transduction regulator, Mothers against decapentaplegic homolog 4 ( Smad4 ) with respect to intestinal adenoma phenotypes and specific TGF-β dependent gene expression. Conditional Lgr5 - Cre activation ( Apc fl/fl Smad4 fl/fl Lgr5 CreER T2 ) resulted in loss of function of Apc and Smad4 , reduced small intestinal adenoma burden, yet discordant development of large caecal adenoma with nuclear localisation of phospho-Smad2/3. Apc Δ/Δ Smad4 Δ/Δ adenoma organoids resisted TGF-β1 induced cell death and EMT (IC 50 534pM) compared to Apc Δ/Δ Smad4 +/+ (IC 50 24pM). TGF-β1 (390pM) modified adenoma bulk mRNA gene expression (RNA-Seq), with decreased Id1 and high Spp1 in Apc Δ/Δ Smad4 Δ/Δ . Single cell RNAseq of caecal adenoma identified Lgr5 low , Pak3 high and Id1 low progenitor populations in Apc Δ/Δ Smad4 Δ/Δ , that also correlated with poor prognosis in colorectal cancer (TCGA). Smad4 loss of function-TGF-β1 dependent Id1 low , Spp1 high and Pak3 high in intestinal epithelial progenitor cells are specific gene-pathway biomarkers for further evaluation in intestinal cancers.

Insights into oncogenesis derived from cancer susceptibility loci could facilitate better cancer management and treatment through precision oncology. However, therapeutic applications have thus far been limited by our current lack of understanding regarding both their interactions with somatic cancer driver mutations and their influence on tumorigenesis. Here, by integrating germline datasets relating to cancer susceptibility with tumour data capturing somatically-acquired genetic variation, we provide evidence that single nucleotide polymorphism (SNPs) and somatic mutations in the p53 tumor suppressor pathway can interact to influence cancer development, progression and treatment response. We go on to provide human genetic evidence of a tumor-promoting role for the pro-survival activities of p53, which supports the development of more effective therapy combinations through their inhibition in cancers retaining wild-type p53.